JACS 2025 | CycloBot：基于二氨基烟酸支架的高纯度头尾环肽自动化快速合成
今天介绍的这项工作来自 Journal of the American Chemical Society。该研究围绕环肽化学合成效率低、操作复杂、难以与生物合成速度竞争这一长期问题,提出了一种以自动化和化学选择性为核心的解决方案。作者构建了一个名为CycloBot的全自动流动合成平台,并设计了一种全新的二氨基烟酸 (DAN) 支架,使头尾环肽能够在固相条件下通过“一键式”操作完成链延伸、活化、环化与切割。该文首先从环肽在药物研发中的重要性出发,系统分析了核糖体合成、非核糖体合成与传统化学合成在速度、结构多样性和规模化方面的优缺点,指出头尾环化步骤是限制化学方法效率的关键瓶颈。在此基础上,作者通过对多种连接臂策略的比较与优化,提出了DAN支架这一核心设计,实现了极高的化学选择性和极低的副反应水平,为自动化操作提供了必要前提。该文详细介绍了CycloBot平台的硬件结构与软件控制逻辑,展示了该系统如何在分钟尺度内完成环肽合成,并通过多个模型肽系统性验证了其在反应时间、收率、粗品纯度以及立体化学保真度方面相对于传统方法的显著优势。在应用层面,作者利用该平台快速合成了多种已知生物活性环肽,并在一天内构建了一个抗菌环肽文库,成功筛选出抗菌活性显著优于青霉素的候选分子,直观展示了该技术在药物发现中的实用价值。总体而言,该文展示了一种将化学合成的结构多样性与自动化技术的速度优势相结合的新型环肽合成范式,为环肽药物的快速发现、个性化设计与规模化制备提供了具有普适意义的技术基础。
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0 摘要
环肽在结构稳定性和靶标特异性方面兼具生物大分子的优势,同时又具备小分子在化学合成上的高度灵活性。然而,在合成速度和效率方面,环肽的化学合成长期以来明显落后于核糖体介导的生物合成。该文提出了一种名为CycloBot的全自动合成平台,可在分钟尺度内实现环肽的全自动组装,其通量接近核糖体生物合成,并且同时兼容天然与非天然氨基酸。该技术的核心在于一种二氨基烟酸 (DAN) 支架,该支架可在固相条件下通过“一键式”操作同步完成头尾环化与切割反应,从而获得不同环尺寸的宏环肽,最高收率可达93%,粗品纯度超过95%,且几乎不发生消旋反应。该平台的实用性通过其在1天内快速构建包含20个成员的抗菌环肽文库得到了充分展示,其中筛选得到的先导化合物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抗菌活性相较于青霉素提高了约100倍。通过在核糖体合成速度与化学合成可实现的结构多样性之间建立连接,该技术为个性化环肽治疗药物的加速发现与开发确立了一种新的研究范式。
1 引言
自第二次世界大战期间首个环肽药物短杆菌肽S被发现以来,环肽逐渐发展成为一类重要的治疗分子。到2024年10月为止,已有120种肽类药物获得监管批准,其中环肽约占44%,且平均每年有一种新的环肽药物进入市场。其临床成功主要源于一系列内在优势,包括更高的抗蛋白酶降解能力、良好的膜通透性、较低毒性、较强的靶标亲和力,以及调控传统上被认为“不可成药”蛋白的能力。因此,环肽已被广泛应用于多种疾病领域,涵盖细菌和病毒感染、癌症、肥胖以及免疫系统相关疾病 (图1a)。
天然环肽通常由核糖体根据基因编码序列在数分钟内完成生物合成,并在特定环化酶的催化下经历翻译后修饰和闭环过程,而非核糖体肽合成酶则通过非模板依赖的酶促装配方式生成结构多样的类似物 (图1b)。然而,核糖体合成在本质上受限于天然氨基酸种类,而非核糖体途径尽管具有更高的化学多样性,却受到生物合成速率缓慢、模块底物专一性强以及难以实现高通量或大规模生产等问题的制约。相比之下,化学合成能够提供更大的结构灵活性,可引入非天然残基并构建更复杂的肽结构,但其中的宏环化步骤,尤其是头尾环化,在合成上依然极具挑战性。这一关键过程需要形成热力学上不利的预环化构象以促进分子内成键,而线性前体中普遍存在的全反式酰胺构象会拉伸肽链骨架,从而阻碍环化并诱发二聚或寡聚等副反应。
传统的均相头尾环化方法通常采用2-氯三苯甲基氯化物树脂及缩合试剂 (图1c),但往往伴随C端消旋、反应时间长、操作繁琐以及对环尺寸和序列高度敏感等问题。此外,为抑制分子间寡聚反应,通常需要使用大量N,N-二甲基甲酰胺 (图1c)。其他连接策略,如天然化学连接反应,可通过N端半胱氨酸参与的硫酯介导偶联高效生成环肽,但需要额外的去硫步骤。丝氨酸或苏氨酸连接、α-酮酸-羟胺连接以及Staudinger连接等方法,则依赖预先引入的特定官能团或氨基酸来驱动环化过程。
固相头尾环化为简化合成流程提供了一种可行途径,该策略可避免中间体分离,并利用“伪稀释效应”促进分子内环化。此类方法通常在靠近树脂的肽链C端引入活性酯型连接臂以诱导闭环,但相关报道仍较为有限。现有商业化体系多采用Boc化学体系,存在耐酸性不足的问题。其他连接臂体系虽然可通过不同机制实现环化,但往往需要较为苛刻的反应条件,产物纯度有限。基于谷氨酸或天冬氨酸侧链固定的策略虽可结合微波或流动合成将反应时间缩短至数小时,但对序列中必须包含特定残基的要求限制了其通用性。
近年来,自动化合成技术显著推动了药物候选分子的快速、高效和可重复制备,加速了化合物库的构建并提高了供应稳定性。连续流动合成平台已成功实现多种小分子的自动化制备,高温流动体系也显著提升了蛋白质合成速度,类似的自动化策略同样改善了核酸药物的合成效率。在此背景下,该文报道了一种集成式自动化平台CycloBot,并配套开发了控制软件AutoXpert,实现了从氨基酸出发、分钟尺度内完成头尾环肽“一键式”合成。该技术的核心在于一种理性设计的二氨基烟酸 (DAN)支架,能够精确控制单链或双链延伸与环化路径,从而合成不同尺寸的宏环肽,最高收率可达93%,粗品纯度超过95% (图1d)。该平台可快速构建毫克到克级规模的环肽文库,同时兼容天然与非天然氨基酸,且消旋程度极低。该文中展示了在1天内合成的20成员抗菌环肽文库,其中筛选得到的先导化合物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的活性较青霉素提高约100倍。该研究为环肽的快速合成提供了一种高效且通用的替代方案,并推动了个性化环肽治疗药物的发展。
图 1 | 基于CycloBot平台的头尾环肽自动化合成总体示意。 (a) 环肽在肽类药物领域中占据重要地位。 (b) 核糖体生物合成能够在极短时间内快速生成宏环肽,通常仅需数分钟。 (c) 不同头尾环六肽合成方法的对比。其中,基于DAN的策略可高效合成cyclo-GITVIF,其粗品纯度通过LC-MS进行评估,分离收率则采用
2 结果
2.1 化学选择性的DAN支架实现“一键式”合成
为了在固相条件下实现快速、高温且可自动化的环肽合成,连接臂的设计至关重要。理想的支架结构不仅需要支持高效的肽链延伸,还应在温和条件下实现选择性的头尾环化。具体而言,该类连接臂需满足若干关键要求,包括合成简便,在常温及高温下具备良好的热稳定性和抗氧化性;具有足够高的反应活性,以确保氨基酸偶联和环化过程高效进行;在化学选择性上能够清晰区分肽链延伸位点与活化位点,从而避免副反应的发生;同时还需与自动化合成平台兼容,避免使用腐蚀性试剂、苛刻反应条件或过长反应时间。
研究首先评估了Kenner型磺酰胺连接臂,并结合2-碘乙腈作为亲电活化剂 (图2a,R1)。尽管该体系表现出一定的选择性,但整体收率和粗品纯度较低,且脱保护过程依赖三氟乙酸,这与自动化仪器并不兼容。随后考察了芳基肼连接臂 (R2),该结构可在铜或铁盐作用下经氧化转化为重氮中间体实现活化。然而,金属氧化剂在微流控通道中易造成堵塞,从而限制了环化过程的自动化实施。
为克服上述问题,研究引入了此前用于天然化学连接反应的二氨基苯甲酸 (DBz) 连接臂,以实现可控的环化过程。该结构中的两个氨基在功能上相互正交,一个用于肽链延伸,另一个用于活化并驱动环闭合。初步尝试在芳环上引入氧或磺酰基作为固定连接臂时,未能获得任何环化产物 (R3,R4) 。相比之下,当引入酰胺键连接方式后,可以生成目标环肽 (R5),但由于延伸位点与活化位点的反应活性相近,导致竞争性双酰化反应,单酰化与双酰化产物比例约为65:35。进一步对树脂和连接基团进行修饰 (R6–10) 并未显著改善选择性。通过在其中一个氨基位点引入空间位阻较大的取代基,如MeDbz连接臂 (R11–12),化学选择性有所提升,但所采用的活化试剂对硝基苯基氯甲酸酯在DMF中反应性不理想,不仅降低了收率,也增加了纯化难度。
在此基础上,研究者通过理性设计提出了一种以吡啶为核心的二氨基烟酸 (DAN) 支架,实现了显著改进。吡啶氮的吸电子效应选择性地削弱了邻近氨基的亲核性,使活化步骤中的化学选择性显著提高,单酰化与双酰化产物比例达到99:1 (图2a,R13)。在温和条件下使用异戊基亚硝酸酯进行活化时,DAN连接臂能够通过“一键式”操作同步完成环化与切割,所得环肽粗品纯度最高可达95%,并获得优异的反应收率。值得注意的是,反应过程中唯一可检测的副产物为二异丙基乙胺,极大简化了后续纯化流程。总体而言,DAN支架为环肽的自动化合成提供了一种简洁而稳健的解决方案,构成了实现高通量环肽文库构建的关键支撑技术。
2.2 CycloBot实现分钟级自动化合成
为进一步提升合成通量与结果的可重复性,研究构建了一套集成式、全自动的流动合成平台,命名为CycloBot (图2b)。该系统由七个相互连接的模块组成,分别负责控制、试剂存储、输送、切换、反应、检测以及产物收集。反应模块配备了三个可独立调控的加热区,能够在连续步骤中实现精确的温度控制,同时引入试剂循环回路以减少氨基酸的消耗。整体合成流程被划分为三个全自动阶段,依次为线性肽链延伸、DAN连接臂活化以及头尾环化。
在合成初始阶段,氨基酸储备溶液通过可编程泵与DIEA (体积分数10%,溶于DMF) 及偶联试剂O- (7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐 (HATU) 混合。所得混合液流经高温通道A (90°C),在此完成活性酯的生成。同时,9-芴甲氧羰基 (Fmoc) 保护基的脱除也在同一通道中原位进行,从而实现肽链的连续延伸。上述循环不断重复,直至获得目标线性肽序列。
随后,体系被切换至保持室温的通道B,在30秒内引入异戊基亚硝酸酯以实现DAN连接臂的选择性活化。活化完成后,溶液立即进入设定为50°C的通道C,在DMF中加入体积分数1%的DIEA,并在180秒内完成分子内头尾环化反应。反应结束后,产物被直接输送至收集模块,全程无需人工干预。
CycloBot的运行由自主开发的软件AutoXpert通过图形化界面进行控制,该软件可执行预设的数字化合成程序,并实现反应参数的实时监测。在310 nm处监测到的紫外吸收信号对应Fmoc脱除过程,可用于定量评估脱保护效率、偶联可靠性以及树脂传质情况;而在220 nm处观察到的信号变化则可作为分子内环化发生及完成情况的可靠指示 (图2c)。该系统的性能通过合成具有较大空间位阻的模型肽cyclo-GITVIF得到了验证,该六肽宏环在24分钟内完成合成,收率为93%,粗品纯度达到95% (图2e)。值得注意的是,最终环化步骤中使用的DIEA是唯一可检测到的杂质,且在后处理过程中易于去除,显著简化了纯化流程。总体而言,CycloBot实现了从氨基酸单体出发、分钟尺度内自动获得高纯度环肽的合成能力。
图 2｜DAN连接臂的开发、自动化合成硬件及性能评估。 (a) 用于实现高效无痕环化的DAN连接臂的设计与结构优化。 (b) CycloBot流动合成平台及AutoXpert控制软件的示意图,包括系统整体架构与流体通路。 (c) 在AutoXpert控制下对关键合成步骤进行实时监测,涵盖肽链延伸、活化 (Act.)与环化 (Cycl.)过程;为确保首个氨基酸在DAN树脂上的完全负载,首次偶联步骤进行了两次。紫外信号用于反映合成步骤的推进情况,而非产物的定量信息。(d) 完整合成循环的时间轴示意,包括脱保护 (Deprot.)、活化与环化步骤,其中Temp.表示温度,相关细节见补充信息第4.5节。(e) 以cyclo-GITVIF为例的代表性合成结果,粗产物未经纯化直接通过LC-MS分析,并依据色谱峰形评估纯度;产物收率通过
2.3 更高的效率、纯度与立体化学保真度
为系统评估DAN介导的流动合成策略相较传统方法的性能优势,研究选取此前通过微波辅助固相肽合成制备的环七肽cyclo-GVYLHIE (1) 作为代表性模型。在已报道的方法中,需在肽序列中预先引入一个谷氨酸残基,并利用其侧链羧基将肽链锚定在树脂上,随后在合成完成后进行切割。该路线完成全序列组装及环化约需133分钟,所得粗品纯度为78% (图3a,左)。为进行直接对比,研究分别采用工业中常用的CTC树脂手工合成流程以及自动化DAN平台开展平行实验。手工方法至少需要8个独立步骤,总耗时约4天,且在环化过程中需大量使用DMF以抑制分子间寡聚反应,最终获得的产物粗品纯度为64%。相比之下,基于DAN的自动化策略在27分钟内即可完成肽链延伸、连接臂活化及头尾环化等全部步骤,所得环肽粗品纯度超过90%。无论是在保护态还是全脱保护态下,通过DAN流程获得的肽样品均表现出显著更高的粗品纯度,这一结果已通过LC-MS分析得到验证 (图3a,右),且所有数据均来自未经纯化的原始产物。
为考察DAN策略在不同环闭合位点下的适用范围及其潜在限制,研究进一步分析了环化位点选择对反应效率的影响 (图3b)。以两个六肽序列cyclo-EGYLTA (2)和cyclo-GITVIF (3)为模型,分别在六个不同位置进行环闭合。12种构型中有11种能够以中等至优良的收率获得相应宏环肽,整体收率范围为36%至93%。需要指出的是,当环闭合位点涉及空间位阻较大的氨基酸残基时,环化效率显著降低,例如在N端以异亮氨酸为闭环位点的cyclo-IFGITV (3c),收率低于5%。这一现象构成了当前DAN连接臂策略的主要局限,在实际环肽设计中需加以充分考虑。
鉴于某些氨基酸在肽键形成过程中易发生消旋,研究进一步评估了DAN介导环化反应的立体化学保真度 (图3c)。通过自动化平台合成了一系列六肽cyclo-GITVIX,其中X分别为苯丙氨酸、丝氨酸、组氨酸或半胱氨酸,这些残基在常规偶联条件下具有较高的消旋倾向。结果显示,上述四种序列均几乎未发生消旋,其非对映体比分别达到>99:1、98:2、95:5和96:4。所观察到的高立体化学完整性主要归因于DAN平台反应动力学快、反应条件温和,以及在活化过程中无需外加碱,从而有效抑制了传统环肽合成中常见的消旋途径。
图 3|DAN介导环化反应在效率、位点效应及立体化学保真度方面的对比评估。 (a) 模型环七肽cyclo-GVYLHIE (1) 通过三种不同策略合成的结果对比:左上为在传统CTC树脂上进行的手工固相合成;左中为已报道的微波辅助自动化合成方法,其中引入谷氨酸残基作为锚定基团;左下为在DAN树脂上无需预先安装序列的全自动合成。右侧为CTC方法与DAN方法的直接对比,基于未纯化样品的LC-MS分析结果,清晰展示了反应时间 (4天对比27分钟) 和粗品纯度 (64%对比>90%) 之间的显著差异。(b) 采用DAN策略研究环闭合位点对环化效率的影响,以cyclo-EGYLTA (2) 和cyclo-GITVIF (3) 两个模型肽为例,每个序列分别考察6个不同的环化位点。收率通过
2.4 对多种氨基酸类型与宏环尺寸的广泛兼容性
为系统评估DAN介导环化策略的适用范围,研究对其在不同氨基酸类型和环尺寸条件下的兼容性进行了全面考察 (图4)。研究首先从一个极具挑战性的最小环体系入手,即在溶液相合成中极易发生二聚反应的二肽环cyclo-RG (7)。在DAN策略下,该目标环肽在12分钟内经6个步骤即可完成合成,总收率达到84%,LC-MS分析显示粗品纯度超过95%,且未检测到任何二聚副产物。相比之下,在相似条件下合成的三肽和四肽环体系则仍然观察到明显的二聚现象。值得注意的是,从五肽环开始,分子间二聚反应几乎不再出现。两种五肽环在21分钟内完成合成,总收率为62%至75%,粗品纯度均超过90% (8,9)。
在药物研发中具有重要意义的六肽环体系同样得到了高效合成,其在24分钟内完成反应,总收率介于64%至75%之间 (10–13)。在此基础上,环尺寸进一步逐步扩展至13个氨基酸残基,即7至13元宏环 (14–21),整体仍保持较高的反应可靠性和合成效率。其中最长的序列 (21) 在45分钟、28个反应步骤后获得,总收率为37%,粗品纯度仍高于90%,充分体现了该体系在更长序列空间中的稳健性。在所有示例中,20种蛋白源性氨基酸均可顺利引入,显示出该策略对常规氨基酸残基的良好兼容性。
为进一步拓展化学多样性和潜在治疗应用价值,研究还评估了非天然氨基酸的引入情况。例如,含有二氨基丁酸这一赖氨酸类似物的环肽可通过DAN策略以62%的总收率获得 (22)。在生物正交化学中常用的炔基和叠氮基团也能够顺利引入,从而制备出可用于点击反应的环肽 (23,24),其总收率分别为48%和72%,粗品纯度均超过90%。鉴于荧光标记在生物分析中的广泛应用,研究还合成了带有7-甲氧基香豆素-3-羧酸标记的环六肽,该反应在24分钟内完成,收率为52%,且保持较高的粗品纯度 (25)。此外,N-甲基化由于空间位阻效应在合成上通常较为困难,但在该体系中,N-甲基化的环六肽仍可在24分钟内成功制备,总收率为68%,粗品纯度优良 (26)。综合来看,这些结果充分表明,基于DAN的环化策略在底物范围和官能团耐受性方面具有显著优势。
图 4| 不同环尺寸下天然与非天然环肽的自动化快速合成。 所有粗产物均直接从自动化合成系统中收集,未经纯化即通过LC-MS分析以评估粗品纯度。产物收率采用
2.5 用于快速环肽合成与生物活性评估的多功能平台
现代治疗手段的发展与药物发现平台的技术创新密切相关。为应对感染性疾病、癌症及遗传性疾病领域中日益增长的个性化用药需求,在CycloBot体系内进一步构建了一种双反应器架构,以同时满足高通量筛选与可规模化生产的需求 (图5a) 。其中,基于微孔板的微反应器用于毫克级合成,可在药物早期发现阶段实现肽库的快速构建;与之并行的柱式宏反应器则支持克级规模合成,适用于先导化合物的后续优化与临床前研究。这两类反应器在统一的软件控制系统下运行,可根据合成需求实现灵活切换。
为验证该平台的实际适用性,研究利用微反应器在30分钟内完成了三种具有生物活性的宏环肽的合成,包括Cyclohexapeptide-9 (27) 、Phakellistatin 13 (28) 以及Heterophyllin A (29)。所得粗产物具有较高纯度,无需预先纯化即可直接进行整体脱保护处理,随后通过简单的快速柱色谱即可获得分析纯的毫克级样品 (图5a)。此外,研究还在柱式反应器中完成了源自云南繁缕的细胞毒性环七肽Yunnanin C (30) 的克级合成,该过程使用3.6 g负载DAN的树脂 (装载量为0.36 mmol/g),并通过试剂循环仅消耗每种氨基酸3当量,在125分钟内完成合成,所得粗品纯度超过80%,经最终纯化后获得0.5 g目标产物,分离收率为53% (图5b)。
由于结构刚性强且对蛋白酶具有较高耐受性,环状抗菌肽被认为是极具潜力的新一代抗生素分子。为探索这一化学空间,研究借助CycloBot平台构建了一个以四种天然环状抗菌肽为原型的定向文库,包括Tyrocidine A、Desotamide B、Wollamide B和Thermoactinoamide A。通过序列工程手段,如引入D-氨基酸、镜像反转、疏水与亲水残基互换以及非天然残基掺入等方式,在一个工作日内成功合成了包含20个成员的环肽文库 (图5c,31–50)。随后以青霉素为对照,对该文库在金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌中的抗菌活性进行了评估。结果显示,部分环肽 (如32和35) 的最低抑菌浓度低至
图 5| 面向治疗研发的环肽快速合成与生物活性筛选。 (a) 在毫克级规模下,抗衰老候选分子Cyclohexapeptide-9(27)以及抗癌候选分子Phakellistatin 13(28)和Heterophyllin A(29)均在数分钟内完成合成。(b) 利用每种氨基酸单体3当量并结合制备型HPLC纯化,在125分钟内实现了抗癌候选分子Yunnanin C(30)的克级合成,最终获得53%的分离收率。(c) 采用CycloBot平台在1天内构建了一个包含20个成员的环肽文库,并用于抗菌活性筛选。体外抗菌实验分别在金黄色葡萄球菌(S. aureus,ATCC 29213)和枯草芽孢杆菌(B. subtilis,ATCC 6633)中进行,以青霉素作为阳性对照(n=3,误差线包含于数据点内);肽序列中大写字母表示(L)-氨基酸,小写字母表示(D)-氨基酸。
3 结论
综上所述,该研究基于二氨基烟酸 (DAN) 支架构建了一种全自动、高速且具有高度立体化学保真度的头尾环肽合成平台。模块化的CycloBot系统将实时控制、在线监测与多尺度反应器设计有机结合,使高纯度环肽能够在分钟尺度内完成制备。该合成策略在不同环尺寸条件下均表现出良好的适用性,可兼容多种天然与非天然氨基酸,且在无需高稀释条件或外加碱的情况下显著降低了消旋反应的发生。
该平台已成功应用于多种生物活性宏环肽及功能化肽偶联物的合成,充分验证了其在实际药物研发场景中的可行性与优势。整体而言,基于DAN的自动化合成方法为环肽的快速发现、结构优化以及潜在治疗应用提供了一种高效而通用的技术路径,在环肽药物研发领域展现出广阔的应用前景。