Nature 2025 | 金属水解酶的计算设计

今天介绍的是发表在 Nature 的论文《金属水解酶的计算设计》。该研究围绕从头酶设计这一长期挑战展开,提出并验证了一种全新的生成式人工智能框架RFdiffusion2,用于直接从量子化学计算得到的活性位点几何结构出发设计高效金属水解酶。不同于以往需要预先指定催化残基序列位置和主链构象的方法,RFdiffusion2能够在推理过程中同时探索序列空间与构象空间,显著拓展了可采样的设计范围。

研究以锌金属水解酶为模型体系,在无需实验优化的情况下,成功获得多种催化效率达到${10}^4\sim {10}^5{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$的设计酶,其性能已接近甚至达到天然金属水解酶水平。结合PLACER和Chai-1对活性位点预组织化的评估,工作系统展示了高效催化与精确底物定位之间的关系。这项研究不仅在方法上推动了从头酶设计的发展,也为未来快速构建高性能人工催化剂提供了通用范式。

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• 📄 论文: https://doi.org/10.1038/s41586-025-09746-w
• 💻 代码: https://github.com/baker-laboratory/PLACER

0 摘要

从头酶设计旨在构建包含理想活性位点的蛋白质,使催化残基围绕并稳定目标化学反应的过渡态。生成式人工智能方法RFdiffusion能够解决这一问题,但需要为每个催化残基同时指定序列位置和主链坐标,从而限制了构象采样的范围。这里介绍RFdiffusion2,该方法消除了上述限制,并被用于从量子化学计算得到的活性位点几何结构出发设计锌金属水解酶。

在最初实验测试的96个设计中,活性最高的酶其催化效率$k_{cat}/K_M$达到16000 M⁻¹ s⁻¹,相比此前报道的金属水解酶设计提高了数个数量级。第二轮包含96个设计的实验又获得了3个高活性酶,$k_{cat}/K_M$最高可达53000 M⁻¹ s⁻¹,催化速率常数$k_{cat}$最高为1.5 s⁻¹。

这四个最活跃设计的结构模型不仅彼此不同,也不同于已知蛋白结构,而其中活性最高设计的晶体结构与其设计模型高度一致,表明该设计方法具有很高的准确性。基于PLACER和Chai-1的预测,这些高活性酶具有预组织化的活性位点,能够有效定位底物,使被金属离子活化的水分子进行亲核进攻。无需实验优化即可直接通过计算生成高活性酶的能力,有望推动新一代高效人工催化剂的出现。

1 结果

金属水解酶通过其结合的金属离子活化一分子水,并将其定位在待断裂的底物键附近,从而催化生物体系中一些最具挑战性的水解反应。由于人类产生的环境污染物出现时间较短,尚不足以在自然进化中产生高效的水解酶,因此工程化构建新的金属水解酶在当前具有重要意义。蛋白质工程已经拓展了金属水解酶可作用的底物范围,但通常依赖于最初存在的催化多功能性。从头酶设计曾被用于生成新的金属水解酶,但其活性和效率普遍较低,且需要大量定向进化才能接近天然酶的水平。

在给定理想金属水解酶活性位点的前提下,从头酶设计的目标是识别或生成一种蛋白质骨架,以高精度将催化残基、金属离子和底物定位在最优的催化几何构型中。RFdiffusion已被成功用于活性位点的支架化设计,但其搜索受到限制,因为必须事先指定催化残基的序列位置和构象。研究者由此提出,如果一种生成式人工智能设计方法仅需指定围绕反应过渡态的侧链官能团位置,并能够在所有可能的序列位置和构象之间进行采样,将更容易满足复杂的催化约束。基于这一思路,研究开发了一种新方法,并利用其从包含金属辅因子的量子化学活性位点描述出发设计新的金属水解酶。

图1｜RFdiffusion2设计方法。 a，4MU-PA的水解反应生成苯乙酸和具有荧光的香豆素产物。b，Zn(II)-氢氧根对4MU-PA酯键进行亲核进攻的theozyme示例,左为二维示意图,右为基于DFT的三维模型,三维模型中的箭头表示所采样的构象柔性。c，使用以往以主链为中心的RFdiffusion(上排)与以相互作用官能团为中心的RFdiffusion2,围绕输入theozyme生成蛋白支架的对比。RFdiffusion需要事先显式采样侧链构象和残基序列位置,而RFdiffusion2仅需过渡态复合物和催化侧链官能团,并在推理过程中隐式采样序列空间和旋转异构体空间。d，模型XT在RFdiffusion2推理轨迹中全局结构和活性位点的若干快照。在推理过程中,输入的过渡态复合物和催化官能团坐标保持固定,而主链结构、序列位置以及催化侧链中未指定的原子由RFdiffusion2进行采样。轨迹结束时承载催化组氨酸的$C_{\alpha }$原子被回顾性地标示为红色球体;这些$C_{\alpha }$原子并非预先设定,而是在整体结构围绕基序形成的过程中进入合适位置以连接固定的侧链。

为实现对序列位置和侧链旋转异构体不敏感的酶设计,研究者开发了基于流匹配的生成式人工智能模型RFdiffusion2。与RFdiffusion相比,RFdiffusion2在两个关键方面扩展了活性位点支架化能力。首先,它支持原子级子结构支架化,不再局限于主链层面的基序,而是可以处理任意氨基酸重原子的子集,从而只需指定与反应过渡态直接相互作用的关键官能团位置。其次,RFdiffusion2实现了与序列位置无关的支架化,无需预先给定基序残基在一级序列中的位置。该模型通过在训练过程中同时提供随机选择的原子坐标和部分加噪且带有序列标注的原子坐标,在推理阶段能够在整个搜索空间内解析这些先验未知的自由度。

借助这些改进,RFdiffusion2可以直接从由官能团位置和底物坐标组成的催化构型出发生成多样化的蛋白质。让模型在推理过程中自行解析催化残基的序列位置和侧链构象,相比在推理前随机采样这些自由度更为高效,因为这一空间过于庞大,几乎无法穷举。关于RFdiffusion2训练过程及其在多种活性位点支架化任务中的系统评估,已有详细报道。

图2｜活性表征与PLACER预组织化评估。 a，最活跃设计的结构模型,下方标注了序列长度(以氨基酸数计)以及各催化组氨酸所在的二级结构类型。b，反应进程曲线,黑色虚线表示缓冲液背景。c，A1(ZETA_1)的米氏动力学表征,纵轴为初始速率$v_0$除以总酶浓度$[E{]}_0$。d，最活跃设计的米氏动力学参数。e,f，PLACER生成的活性位点预组织化集合指标分布,分别为各设计中底物设计-预测平均r.m.s.d.(e)以及催化和结合残基设计-预测平均r.m.s.d.(f)。g，对于ZETA_1,PLACER集合中底物位置接近设计模型,而在无活性的设计H7中,底物位置波动较大。h，对于ZETA_1,活性位点周围的侧链位置大多固定并接近原始设计模型,而在无活性的H8设计中,侧链位置变化显著。g,h中仅显示PLACER随机生成且未排序的前五个集合预测。数据表示三次独立初始速率测量(c)和米氏动力学参数(d)的平均值±标准差。

作为RFdiffusion2的初步验证,研究选择了4-甲基伞形酮苯乙酸酯作为目标反应,设计一种用于其水解的锌金属水解酶。首先通过密度泛函理论确定速率决定步骤中Zn(II)-OH对底物酯键进行亲核进攻的过渡态几何结构。基于四面体中间体的立体化学以及氧阴离子孔的不同特征,共考虑了四种催化构型。这些计算提供了三个Zn(II)结合的咪唑环、金属离子以及过渡态的空间坐标。此前的RFdiffusion方法需要输入主链坐标和残基位置,这意味着必须预先对每个组氨酸的侧链构象和序列位置进行采样,而这一组合空间即便在粗略采样下也高达约${10}^{18}$种可能。RFdiffusion2则能够在单条推理轨迹中探索整个空间。

利用RFdiffusion2的推理轨迹,研究者构建了承载由DFT生成的最小活性位点构型的蛋白质骨架,即theozyme。在推理过程中,残基的$C_{\alpha }$原子最初从高斯分布中采样,而目标官能团原子的位置保持固定,随着轨迹推进,整体蛋白结构逐渐围绕活性位点成型。最终,固定的组氨酸侧链被连接到模型自行选择的主链序列位置上。研究共运行了5120条RFdiffusion2推理轨迹,并对所得骨架利用ProteinMPNN生成序列。对于那些AlphaFold2预测结构与设计模型高度一致的设计,进一步通过LigandMPNN和受约束的Rosetta重排与最小化优化其催化几何和过渡态相互作用。

图3｜ZETA_1活性的表征。 a，ZETA_1设计模型(左),中间为显示催化残基的活性位点放大图,右为设计口袋的表面视图,显示其与底物具有高度形状互补性。b，ZETA_1的体积排阻色谱图,显示单一峰,对应单体蛋白。c，ZETA_1的圆二色谱,在25 ℃至95 ℃范围内每隔10 ℃测量一次(viridis颜色梯度),并在重新冷却至25 ℃后再次测量(灰色)。结果表明ZETA_1具有α螺旋二级结构,并且在加热和部分解折叠后能够复性。MRE表示平均残基椭圆度。d，在222 nm处的圆二色信号,每隔1 ℃测量一次并随温度变化作图。e，产物与酶浓度比值的反应进程曲线显示,ZETA_1每个酶分子可水解超过1000个4MU-PA分子。背景反应已从光谱中扣除,因此每一次转化均可归因于酶催化。f，含Zn(II)的全酶态与无锌的apo态ZETA_1的反应进程曲线,显示活性依赖于锌。在30 min后向apo态样品中加入过量Zn(II)可恢复活性,表明锌对ZETA_1的催化机制至关重要。WT表示野生型。g，野生型及突变体ZETA_1对Zn(II)的亲和力,以解离常数$K_D$表示,数值越小表示结合越紧。h，比较野生型与突变体ZETA_1活性的荧光反应进程曲线。i，活性ZETA_1突变体与野生型的$k_{cat}/K_M$比较。数据表示三次独立测量的转化数(e)、荧光进程曲线(f,h)、Zn(II)解离常数(g)及米氏动力学参数(i)的平均值±标准差。

在满足特定设计标准后,研究者选取了96个设计进行实验表征。这些设计被克隆表达于大肠杆菌中并纯化,其中绝大多数蛋白可溶且成功表达。补充硫酸锌后,通过荧光法监测底物水解活性,发现5个设计表现出显著高于背景的催化活性。进一步纯化并进行米氏动力学分析后,最活跃的设计A1的催化效率$k_{cat}/K_M$达到$16000\pm 2000{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$,其余四个设计的$k_{cat}/K_M$处于$35$至$140{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$范围内,显著高于以往报道的设计型金属水解酶。A1在多次反应循环后仍能保持活性,显示出良好的稳定性。该设计在结构上与已知蛋白显著不同,因此被命名为锌金属酯酶1(ZETA_1)。

ZETA_1不仅在计算筛选中排名最高,其实验结构也被预测与设计模型高度一致。PLACER分析表明其活性位点高度预组织化,催化侧链构象稳定,底物被牢固定位在设计位置。相比之下,无活性的设计在PLACER轨迹中表现出底物显著波动。进一步的实验验证显示,在设计筛选阶段被PLACER指标淘汰的同源骨架确实几乎不具活性,凸显了该方法在设计筛选中的价值。

ZETA_1的活性位点主要由疏水口袋构成,三个组氨酸通过其$N_{\epsilon }$原子配位Zn(II),一个天冬氨酸可能作为一般碱,另一个天冬酰胺与香豆素环形成氢键。Zn(II)在该体系中不仅负责活化水分子,还作为氧阴离子孔稳定过渡态负电荷。去除结合的Zn(II)会完全消除酶活性,而重新补充锌则可恢复活性。锌滴定实验测得其解离常数$K_D$为$41\pm 5\mathrm{nM}$,与先前设计的锌酶相当,但高于天然金属水解酶。

图4｜第二轮设计的表征。 a，包含催化碱的第二轮DFT theozyme。在这些theozyme中,Zn(II)由组氨酸的$N_{\epsilon }$原子配位,因此明确建模了$C_{\beta }$原子。b，按支架家族着色的反应进程曲线。c，各支架中排名最高设计的序列长度及催化残基位置,分别命名为ZETA_2至ZETA_4,这些设计彼此不同,也不同于ZETA_1。d,e，11个第二轮命中设计的稳态$k_{cat}/K_M$和$k_{cat}$参数,颜色方案与b,c一致。整体而言,其活性高于第一轮设计(蓝色)。f–h，ZETA_2(f)、ZETA_3(g)和ZETA_4(h)的设计模型(左)、活性位点放大图(中)以及对应的米氏动力学曲线和参数(右)。数据表示三次独立测量的米氏动力学参数(d,e)和初始速率(f–h)的平均值±标准差。

通过定点突变分析,研究进一步探讨了催化残基对Zn(II)结合和催化的贡献。结果显示,部分组氨酸和天冬氨酸之间可能存在竞争性的锌结合模式,这也得到了Chai-1预测的支持。基于这些发现,研究者在新一轮设计中显式引入催化碱,并使用在更大数据集上从随机权重训练的RFdiffusion2版本生成新的蛋白结构。通过Chai-1和PLACER筛选后,又有96个设计进入实验测试,其中11个表现出显著的锌依赖水解活性,成功率明显高于首轮设计。

第二轮设计中,最活跃的酶ZETA_2的$k_{cat}/K_M$达到$53000\pm 5000{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$,其$k_{cat}$为$1.5\pm 0.1{\mathrm{s}}^{-1}$,接近经多轮定向进化获得的高效金属水解酶水平。不同设计在底物结合模式、骨架折叠以及催化残基序列位置上均表现出高度多样性,体现了RFdiffusion2生成解的丰富性。

通过X射线晶体学,研究解析了ZETA_2的无底物结构和结合Zn(II)后的结构。实验结构与设计模型在主链层面高度一致,催化残基保持设计构型,活性口袋与过渡态形状互补,进一步验证了该计算设计方法在原子层面上的准确性和可靠性。

图5｜ZETA_2的晶体结构与设计模型高度一致。 a，ZETA_2在apo态下的设计模型与X射线晶体结构(PDB:9PYJ)的$C_{\alpha }$叠合,分辨率为3.5 Å,催化残基以棒状表示。两者高度一致,$C_{\alpha }$ r.m.s.d.=1.1 Å,实验结构中的催化残基已在接近设计的催化几何构型中预组织化。b,c，ZETA_2活性位点的放大图,分别突出显示实验结构与设计催化几何的一致性(b),以及设计的结合口袋与过渡态模型之间的形状互补性(c)。所有面板中晶体结构以灰色显示,设计模型以彩色显示。

2 结论

研究表明,RFdiffusion2能够直接从量子化学计算得到的活性位点构型出发,生成具有高活性的金属水解酶。在完全不进行实验优化的情况下,零样本设计获得的酶ZETA_1其$k_{cat}/K_M$超过${10}^4{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$,并且在直接从计算机得到并测试的96个设计中排名最高,这对于从头酶设计而言是一次显著突破。此前,达到这一活性水平通常需要大量的设计筛选和定向进化。该设计策略的稳健性还体现在另一组同样直接从计算机生成并测试的96个设计中,又成功零样本获得了3个高活性酶,其中ZETA_2和ZETA_3的$k_{cat}/K_M$均超过${10}^4{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$,ZETA_4的$k_{cat}/K_M$超过${10}^3{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$。ZETA_1至ZETA_4在结构上彼此差异显著,且均不同于此前已知的蛋白结构。

ZETA_1至ZETA_3的催化效率已处于具有相似底物的天然金属水解酶常见范围内,即$k_{cat}/K_M={10}^4\sim {10}^6{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$,并且高于所有此前在优化前报道的设计型金属水解酶。对ZETA_1和ZETA_2的实验表征提供了有力证据,表明它们确实按照设计方式发挥功能,利用结合的Zn(II)离子活化水分子进行亲核进攻,并稳定所形成的氧阴离子中间体及其相邻的过渡态。PLACER和Chai-1集合分析结果表明,获得超过${10}^4{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$的$k_{cat}/K_M$的关键在于精确控制底物相对于被活化水分子和Zn(II)离子的空间定位。

未来的金属水解酶设计若能够在以下方面进一步改进,有望将活性提升至最活跃天然金属水解酶的水平:一是将一般碱定位在不易重新构型并与金属离子相互作用的位置,如ZETA_1中所示;二是更好地预组织金属结合残基;三是进一步引入侧链对氧阴离子的稳定作用。RFdiffusion2与PLACER相结合的设计策略相较以往从头酶设计方法具有多方面优势,并且有望广泛适用于为多种化学反应生成高效催化剂。通过直接对侧链官能团进行支架化,而非像RFdiffusion1所要求的那样指定主链$N$-$C_{\alpha }$-$C=O$坐标,RFdiffusion2避免了对催化侧链旋转异构体构象及其在一级序列中位置进行显式枚举的需求,从而使每一条设计轨迹都能够在极其庞大的可能性空间中进行采样,而不是受限于一个很小的子空间。

利用PLACER和Chai-1评估活性位点预组织化程度以及底物-过渡态定位,在筛选最活跃设计方面表现出极高的有效性。这一结果结合此前在从头设计的丝氨酸水解酶和逆羟醛裂解酶中的类似观察,表明PLACER及相关的深度学习方法将在设计排序中具有广泛用途。在实验室实践中,RFdiffusion2–PLACER设计流程已成功用于生成多种断键和成键反应的生物催化剂,这些工具已向社区免费开放,并有望推动更广泛的设计应用与创新。