JACS 2023 | 验证超越“5规则”的口服药物开发新方法：针对细胞内难靶点的环肽策略
今天介绍的是发表在 Journal of the American Chemical Society 上的一项研究工作。针对传统小分子和抗体难以作用的细胞内蛋白–蛋白相互作用（PPI）靶点，提出了一种基于中等分子量环肽的口服药物开发方法。研究通过系统设计和合成具有高 N-烷基化、适中脂溶性及约11个氨基酸残基的环肽库，并结合 mRNA 展示技术筛选出候选肽段，实现了药物化可行性评估。最终优化获得了 KRAS 抑制临床候选化合物 LUNA18，在体内外实验中表现出显著抑制效果和良好口服生物利用度。方法不仅提供了一条可控、可重复的环肽药物发现路径，也为未来开发针对细胞内难靶点的中分子药物提供了科学依据和技术基础。
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0 摘要
建立一种用于创制抑制细胞内蛋白-蛋白相互作用（PPI）临床化合物的技术平台，有望开启许多有价值药物的开发空间。尽管小分子和抗体是主流药物形式，但对于缺乏可供小分子结合的深口袋靶蛋白，或位于抗体难以触及的细胞内空间的蛋白，它们并不适用。进入这些靶点的一种可行方式，是利用所谓的中等大小环肽，即此处定义为分子量 1000-2000 g/mol 的环肽。通过阐明成药样环肽的结构特征和理化性质，并开发可获得高 N-烷基化环肽命中物的文库技术，验证了一种面向细胞内难靶点、用于创制突破五规则口服药物的新方法。KRAS 抑制性临床化合物 LUNA18 被发现，成为这一平台技术的首个实例。
1 引言
要建立中等大小分子药物发现平台，对成药性的深入理解以及能够体现这种成药性的化合物文库可能同样关键。这里的成药性定义为可接受的膜通透性与代谢稳定性之间的兼容。作为中等大小分子的骨架，环肽可能在两个方面具有潜在优势：一是可借助生物技术构建高度多样化的文库用于命中物生成，二是由于构建单元彼此结构相似，成药性的阐明可能更可行。
在 Lipinski”五规则“（Ro5）范围之外，找到能够定义中等大小分子成药性的标准，将使药物开发更具可操作性。已有分子量超过 700 g/mol、超出 Ro5 范围的化合物被报道可抑制 PPI。也有源自天然产物、分子量最高约 1200 g/mol 的药物被报道能够抑制细胞内蛋白或实现口服给药。环肽的典型例子是环孢素，它已作为口服药物被广泛使用。近年来，大量围绕环肽的研究致力于阐明获得膜通透性的因素。然而，类似 Ro5 的通用标准尚未明确。获得具有成药样骨架的命中肽是成功的另一关键，因为在先导优化中，为提高成药性而对骨架进行剧烈改造的需求可以被避免。相反，如果筛选得到的命中物缺乏成药性，后续剧烈的构象变化往往会降低生物活性并导致不兼容。生物活性与成药性之间的不兼容，使得肽类药物发现中难以瞄准难靶点。Ro5 在小分子高通量筛选和结构优化后仍持续指导命中化合物选择，这也体现了成药样命中物的重要性。
图1｜从期望命中化合物（上方）和非药物样化合物（下方)出发的药物发现 易于获得药物样性的肽段骨架可以避免对骨架进行大幅修改，并实现足够的生物活性和药物样性。
作为命中物生成技术，使用含非蛋白氨基酸（NPA）肽文库的 mRNA display 是首选方案，因为 mRNA display 是一种成熟体系，理论上能够生成超过 $ 10^{12} $ 种独特肽。该技术已被成功用于鉴定多种具有生物活性的蛋白、肽，以及近年含 NPA 的环肽。不过，这些实例缺少成药性概念，也尚未建立用于阻断细胞内 PPI 的通用肽类药物发现平台。
2 结果
2.1 成药性区域可由具有更高 N-烷基化程度、更高脂溶性以及约 11 个氨基酸残基的环肽界定。
基于药物发现格式，设计并合成了一系列环肽，这些环肽通过 N 端胺基与 C 端天冬氨酸侧链或其衍生物中的羧酸进行环化。成药性分析旨在明确环孢素的成药性是否只是例外；如果并非例外，则进一步判断是否能够确定赋予肽成药性的特定结构特征。环孢素的特征如下：11 个氨基酸残基，骨架酰胺基中有 7 个 N-烷基，Clog P 为 14.4，含 1 个羟基（下文表示为 OH），分子量（MW）为 1203 g/mol。参照这些参数，所设计肽具有以下特征：8-12 个氨基酸残基，骨架酰胺基中含 0-8 个 N-烷基，Clog P 为 4.4-15.2，侧链功能基团中含 0 或 1 个 OH。N-烷基和 OH 的位置被随机排列，以产生多样化结构。分子量范围为 845-1499 g/mol。
在第一轮包含 553 条肽的筛选中，至少 51 条肽满足体外成药样标准。代谢稳定性通过人肝微粒体（hLM）实验评估，500 条肽中有 336 条（67%）满足内在清除率（$ CL_{int,mic}
分析随后聚焦于 11 残基肽，因为 151 个 11 残基肽化合物中有 34 个满足成药样标准，比例优于更长或更短残基数的肽。8-12 残基环肽中超过 99% 在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）存在时被更多代谢，而在无 NADPH 条件下，多数肽的代谢速率较低并与小分子相当。这表明氧化代谢占主导。该结果与环孢素相呼应；环孢素据报道主要通过 CYP 氧化代谢，而非酶促水解。因此，蛋白水解被推测并非这些肽的主要代谢途径。对于 8 残基肽，较高脂溶性可带来更高膜通透性，但也导致过度氧化代谢。这使兼容性变得困难，因为为获得更高代谢稳定性而需要的较低脂溶性，可能导致膜通透性不足。相比之下，11 残基肽更容易实现兼容：Caco-2 可通透肽中有 76%（34/45）具备代谢稳定性。
在进一步聚焦 11 残基肽的分析中，Clog P 不低于 12.9 且 N-烷基数量不少于 6 个，被确定为以较高成功率获得成药样肽的重要因素。由于第一轮筛选中 34 条成药样 11 残基肽呈现出更高 Clog P 和更高 N-烷基化程度的趋势，因此第二轮又合成了 60 条肽，用于确认这一趋势；这些肽均含 11 个氨基酸残基、Clog P 不低于 12.9、N-烷基不少于 6 个，并含 0 或 1 个 OH。结果显示，95 条肽中有 63 条（66%）满足标准。
图2｜553 个肽段的设计 显示了该研究格式下 11 残基环肽的示意模型、所包含的氨基酸以及 553 个肽段的性质。
随后评估了功能基团类型和数量对Caco-2 $ P_{app} $ 的影响，结果表明 2 个 OH 对获得膜通透性仍可接受。这些结果来自对 214 条肽的评估，这些肽均含 11 个氨基酸残基、Clog P 不低于 12.9、N-烷基不少于 6 个、0-3 个 OH，以及 0 或 1 个离子型功能基团。引入 0-2 个 OH 未观察到对通透性的负面影响，但含 3 个 OH 的肽可能通透性较低：3 OH 为 0/3（0%），相比之下 0-2 OH 合计为 130/189，其中 0 OH 为 54%，1 OH 为 77%，2 OH 为 61%。离子型功能基团，如 5-四唑基、4-咪唑基或二甲氨基，会降低通透性，分别为 0/7（0%）、1/6（17%）和 0/9（0%）。与小分子相比，可接受的极性功能基团数量和类型可能更加受限。
图3｜环肽在第 1、2 和 3 轮筛选中的药物样性 (A, B) 第 1 轮筛选中各残基数肽段在 hLM 中的代谢稳定性 (A) 及 Caco-2 实验中的膜通透性 (B)。每个图下方显示满足标准的肽段数量和百分比。各评估中的肽段数量不一致。$ CL_{int,mic} $ 和 Caco-2 $ P_{app} $ 的标准已在体内实验中确认。 (C) 第 1 和第 2 轮筛选中 11 残基肽段的代谢稳定性和膜通透性。第 1 和第 2 轮筛选中 Clog P < 12.9 或 N-烷基数 <6 的肽段分别用红圈表示，Clog P ≥ 12.9 且 N-烷基数 ≥6 的肽段分别用深蓝圈和点表示。 (D) 第 1、2、3 轮筛选中各类型及数量极性官能团肽段的膜通透性。
2.2 满足成药样标准的肽表现出可接受的口服生物利用度和体内暴露。
13 条体外成药样肽中有 12 条在小鼠体内血浆清除率（CL）低于 10 mL/min/kg；这些肽具有不同特征，例如残基数量、N-烷基数量和模式、Clog P，以及 OH 数量和位置，并且体外小鼠$ CL_{int,mic} $最高为 95 μL/min/mg protein。这些个位数 CL 值与成药样小分子相当。1 条体外小鼠（人） $ CL_{int,mic} $ 为 86（96）μL/min/mg protein 的肽，以及 3 个体外 $ CL_{int,mic} $ 超过 100 μL/min/mg protein 的阴性对照，在体内显示 CL 超过 15 mL/min/kg。因此，体外成药样标准中 $ CL_{int,mic} $ 低于 100 μL/min/mg protein 是合理的。基于小鼠中$ V_{ss} $ 不低于 0.20 L/kg，这 13 条肽显示出体内细胞内分布；而 3 个 Caco-2 $ P_{app} $ 不高于 2.0 ×$ 10^{-7} $ cm/s 的阴性对照，$ V_{ss} $ 明显低于 0.20 L/kg。这些数值与一般认知一致：当化合物仅分布于血液中时，例如抗体，$ V_{ss} $ 约为 0.060 L/kg；当主要分布于血液和组织间液中时，$ V_{ss} $ 最高可达 0.20 L/kg。因此，$ V_{ss} $ 约 0.20 L/kg 或更高的化合物可提示进入细胞。
以 20 mg/kg 对小鼠口服给药这些肽后，13 条肽中有 7 条达到不低于 15% 的生物利用度。该剂量按体表面积折算相当于人体 100 mg/人，并且 $ AUC_{inf} $ 不低于 10000 ng·h/mL，与可口服小分子药物相当。
成药样肽 131 在口服给药后实现稳定暴露，在小鼠、大鼠、犬和猴中的生物利用度分别为 49%、25%、13% 和 20%。化合物 131 在不同动物物种中均显示 CL 低于 10 mL/min/kg、$ V_{ss} $ 高于 0.20 L/kg，且生物利用度约 20% 或更高。
图4｜药物样环肽的药代动力学研究 (A) 小鼠体外 $ CL_{int,mic} $ 与体内 CL 的相关性。 (B) 小鼠 Caco-2 $ P_{app} $ 与$ V_{ss}
2.3 为按照成药样肽标准生产肽，对翻译体系进行了工程化改造。
上述成药样肽标准显示，成药样肽需要具备不同于已报道环肽文库的特征，例如高度 N-烷基化、酰胺环化、高疏水性、适当肽长，以及受限的侧链极性。因此，需要一种新的生物技术翻译体系：（1）连续 N-烷基化氨基酸（NAA）的高效核糖体掺入至关重要，因为 11 残基成药样肽需要 6 个或更多 NAA，很可能产生至少 2 个连续 NAA，而这对常规翻译体系而言较难实现。（2）新的环化方法必不可少，因为肽环化后的产物必须具有代谢稳定性且不能失去膜通透性。涉及二硫键和硫醚键的现有环化方法难以实现代谢稳定性。（3）所有离子型氨基酸都应从文库中移除，并由 Clog P 更高的非离子型氨基酸替代。因此，谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸和酪氨酸这 5 种离子型蛋白氨基酸应被替换。
图5｜改进的连续非天然氨基酸 (NAA) 引入 (A) 氨酰-pdCpA 和 pCpA 的化学结构，差异以红色标出。R 表示取代基。 (B, C) pdCpA 和 pCpA 对单次 (B) 及连续 (C) 引入 NAA 的肽产率。显示平均值 ± SD (n = 3)。 (D) ValRS 的活性位点，突变残基以红色标出。图像根据蛋白质数据银行 (PDB) 条目 IIVS 修改。 (E) 使用 wtValRS (上) 和 mutValRS (下) 翻译产物的 LC-MS 分析。†、‡ 和 § 分别表示错误引入的 Val (†)、Ile (‡) 及含目标 MeVal (§) 的肽段。显示各产物的保留时间及观察和计算的 m/z ($ [M-H]_{-} $)。 (F) pdCpA 和 mutARSs 连续引入 NAA 的肽产率。显示平均值 ± SD (n = 3)。
为评估并提高连续 NAA 掺入，建立了一种评估翻译效率（产率）和准确性（纯度）的分析方法，阐明了较少使用的 pCpA 方法相对于常用 pdCpA 方法的优势，这一点与既往报告相似但更为突出。在这些方法中，化学合成并由 NPA 酰化的 pCpA 或 pdCpA，与缺少 3′ 端 CA 的 tRNA 通过酶促连接，形成由 NPA 酰化的全长氨酰-tRNA。当单个 N-甲基甘氨酸（MeGly；下文将 N-甲基化氨基酸表示为 MeAA）通过 pdCpA 方法和 pCpA 方法掺入时，二者效率与 Leu 相当，pdCpA 产肽量为 2.7 μM，pCpA 为 3.1 μM，Leu 为 4.4 μM，且由非目标氨基酸误掺入导致的副产物低于 10%。相比之下，在含有 2 个连续 NAA 的肽序列中，pdCpA 方法的产肽量降低近两个数量级，为 0.05 μM；而 pCpA 方法几乎维持产率，产率和纯度分别为 1.5 μM 和 86%。另一种 NAA，即（S）-2-（甲氨基）-3-（噻唑-4-基）丙酸（MeAla（4-Thz）），也观察到类似结果。
作为连续 NAA 掺入的另一种尝试，通过使用突变氨酰-tRNA 合成酶（mutARSs），MePhe、MeVal 和 MeSer 的掺入程度达到实用水平。以 ValRS 为例，引入 Asn43Gly 突变以降低活性位点中 MeVal 的 N-甲基造成的空间位阻。mutValRS 以可接受纯度产生含 MeVal 的肽作为主要产物，产率和纯度分别为 4.1 μM 和 78%；而野生型（wt）ValRS 误掺入 Val/Ile，未产生含 MeVal 的产物。这可能是因为增强的 MeVal 氨酰化活性超过了污染性 Val/Ile 误掺入。同样，SerRS 的 Thr237Ser/Glu239Gly 突变以及 PheRS 的 Gln169Gly 突变被确定可增强 NAA 掺入，纯度高于 85%。与 pdCpA 方法相比，使用 mutARSs 后这些 NAA 的连续掺入均提高超过 10 倍；MeSer、MeVal 和 MePhe 的产率分别为 3.4 μM、0.53 μM 和 2.2 μM，而 pdCpA 方法低于 0.05 μM。加上可由野生型 ARSs 掺入的 Pro、MeAla 和 MeHis，共确定 6 种 NAA 可作为通过 ARSs 纳入文库的候选氨基酸。
图6｜使用天然化学连接的酰胺环化方法 (A) 肽段环化的示意图。条件：(1) 环化：30 mM TCEP，37 °C，1 小时；(2) 脱硫：186 mM TCEP，200 mM VA-044，42 °C，2 小时。 (B) 翻译后（上）、环化后（中）及脱硫后（下）肽段的提取离子色谱图。 (C) 四种不同序列肽段环化的 MALDI-TOF 分析。†表示来自 PURE 系统组分的峰 (Figure S14)，‡、§、||和¶表示目标环肽的峰。显示结构及计算与观察的 m/z ([M-H]+)。
为获得符合成药样肽标准的肽，建立了使用天然化学连接（NCL）的酰胺环化方法，即在 MeCys 与含硫酯 NPA（Asp（SMe））之间进行连接，随后进行脱硫反应。为在整个肽文库中安装 NAA，选择 MeCys 而非 Cys。为通过 pCpA 方法掺入 MeCys，胺和硫醇分别由 4-叠氮苄氧羰基（Acbz）和 StBu 基团保护，因为不含保护基的 MeCys 由于 MeCys-pCpA 不稳定而无法掺入。选择 Acbz 和 StBu 保护 MeCys，是因为二者可在温和条件下由三（2-羧乙基）膦（TCEP）同时脱保护，且不会影响其他蛋白或 RNA 的功能。与普通 N-甲酰甲硫氨酸（fMet）起始相比，目标含 MeCys 产物以可接受的产率和纯度被观察到；fMet 产率为 0.30 μM，Acbz-MeCys（StBu）为 0.14 μM，同时误起始产物浓度为 0.09 μM。对于 Asp（SMe）的掺入，目标肽被确认具有与 Leu 掺入相当的产率，Leu 为 0.30 μM，Asp（SMe）为 0.47 μM，且未检测到任何副产物，表明 Asp（SMe）的“反应性”硫酯基团在翻译体系下具有足够稳定性。在 Acbz-MeCys（StBu）与 Asp（SMe）同时掺入并脱保护后，经 MeCys 与 Asp（SMe）之间的分子内反应，翻译得到的线性肽被完全转化为环化中间体。经脱硫后，该中间体进一步转化为目标环肽，其质量显示硫原子丢失。MALDI-TOF-MS 分析显示，另外 4 条不同肽也成功环化，根据 MS 谱峰强度判断，可检测副产物低于 10%，揭示了该方法的通用性和效率。
图7｜肽段文库 (A) 文库中使用的氨基酸化学结构及缩写。 (B) 筛选中使用的密码子表，†和‡分别表示由 ARS 和 pCpA 引入的氨基酸。 (C) DNA 文库设计及生成的环肽文库示意图。在 ATG 和 TAG 之间插入九个随机密码子 XXX，其中 XXX 表示以下密码子之一：TTT、TTG、CTA、ATT、GTT、CCG、ACT、GCT、TAC、CAT、CAG、TGG、CGG、AGT、AGG 和 GGT。由 XXX 转录得到的包含随机密码子 YYY 的 mRNA 被连接到 mRNA 3' 端的嘌呤霉素 (Pu) 连接子。通过该设计，含九个随机氨基酸及间隔肽 PTGTGTGKK 的肽段被翻译，并通过带 RNA 的嘌呤霉素与各自 mRNA 偶联。随后对这些肽段进行酰胺环化，最终形成目标环肽文库。
表1说明 显示药物样肽段的标准及各肽段的参数。标准内的数字以蓝色显示。针对 11 残基环肽，通过 Figure 7B 所示的密码子表计算。
2.4 通过 mRNA display 获得 KRAS 抑制性命中物。
设计并制备了一张由 19 种氨基酸（AA）组成的密码子表，其中包括 10 种 NAA 和 4 种其他 NPA。该密码子表包括用于环化的 MeCys 和 Asp（SMe），以及作为环肽与 mRNA 之间间隔氨基酸所需的 Lys。由于 Lys 极性高，会降低膜通透性，因此仅用于间隔残基，而不用于环肽部分。在设计为含 9 个随机 AA 的 11 残基环肽文库中，理论上 65% 的肽含有 6 个或更多 NAA，满足成药样肽标准。尽管平均 Clog P（6.1）远低于标准（不低于 12.9），且初始文库中只有低于 5% 的肽满足该标准，但这并非关键问题，因为可通过命中肽的侧链修饰提高 Clog P，而无需引发剧烈构象变化。
为验证药物发现概念，将 mRNA display 应用于细胞内蛋白 KRAS。KRAS 蛋白在人类癌症中发挥重要作用，但长期以来被认为是细胞内难靶点。KRAS 表面相对较浅，通常被认为是小分子难以靶向 KRAS 的原因之一。近年来，分子量不低于 500 的中等大小分子共价 KRAS-G12C 抑制药物已被发现。共价抑制剂确定了 KRAS 上的配体结合位点，进而推动了多种 KRAS-G12C 抑制剂的报道。这些 KRAS 抑制剂多数被认为可抑制 KRAS 与 SOS1 之间的界面。SOS1 是 KRAS 的关键鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），可通过促进 GDP 与 GTP 的交换激活 GDP 结合型 RAS。因此，KRAS-SOS1 抑制剂会耗竭活性 KRAS-GTP 并阻断 KRAS 信号。
通过 mRNA display 技术，鉴定出 7 条含 5-7 个 NAA 的环肽作为 KRAS 结合物；其 $ K_{D} $ 值由表面等离子体共振（SPR）测定，为 0.3-2.9 μM。首先，合成理论上超过 $ 10_{12} $ 条肽，其中 mRNA 通过嘌呤霉素基团连接到由环肽 Asp 残基延伸出的间隔肽。其次，针对 KRAS 进行 5 轮筛选和扩增，使靶标依赖性结合活性得到富集。第三，通过序列分析鉴定富集肽，并进行化学合成，随后实施 SPR 结合实验。基于 10 条富集序列中的 NAA 数量，可以判断文库按设计产生了具有预期参数的肽。Alpha-Screen 实验显示，AP8784 抑制 KRAS 与 SOS1 之间 PPI，$ IC_{50} $ 为 180 nM。这提示 AP8784 结合于 KRAS 与 SOS1 的界面，与 AP8784-KRAS 复合物的 X 射线结构分析一致。
AP8784 结合于 Switch II 与 α3-螺旋之间诱导契合形成的疏水裂缝。一个显著特征是，在氢键网络作用下，AP8784 主链以 Gln99 侧链为轴形成类似车轮的结构。AP8784 疏水侧链与 KRAS 表面疏水凹陷之间的范德华接触增强了结合。这说明，由于环肽的疏水特性，该文库能够靶向具有成药潜力的疏水空腔。
2.5 先导优化确定了临床化合物。
通过 AP8784 的结构优化，确定了 LUNA18；该化合物在无细胞实验中对 KRAS 具有强亲和力和抑制活性。AP8784 的化学优化无需骨架跃迁即可实现，这类似于由 Lipinski 五规则指导的小分子药物发现过程。为获得膜通透性，Clog P 的主要探索范围为 13-15。侧链修饰仅使用疏水功能基团，并不需要极性基团来提高生物活性。这些结果符合预期：对于不依赖极性功能基团与靶蛋白结合的命中物，无需使用极性功能基团优化结构。通过侧链修饰获得疏水相互作用所带来的活性增强，导致 Clog P 增加，同时也有助于改善膜通透性。SPR 测得 LUNA18 对 GDP-KRAS-G12C、G12D、G12V、WT 和 GTPγS-KRAS-WT 的 $ K_{D} $ 值分别为 38、33、31、35 和 6400 pM。LUNA18 对 KRAS 与 SOS1 相互作用表现出强效抑制活性；针对 GDP-KRAS-G12C、G12D、G12V 和 WT 的 $ IC_{50} $ 分别为 0.46、0.58、0.55 和 0.42 nM，并表现出成药性：Caco-2 $ P_{app} $ 为 2.3 × $ 10^{-6} $ cm/s，体外人 $ CL_{int,mic} $ 为 48 μL/min/mg protein。
图8｜KRAS 抑制剂的生成 (A) 筛选中富集的前 10 个序列及其性质。肽段的 C 端通过吡咯烷 (pyrro) 酰胺化。在 4 °C 下 (†) 进行结合确认以提高 SPR 响应的灵敏度，同时在 30 °C 下 (‡) 测定 GDP-KRAS-WT 的$ K_{D} $ (n > 3)。N.D.: 未测定。 (B) AP8784 的化学结构。 (C) 通过 AP8784 系列稀释浓度测定 KRAS-WT 与 SOS1 之间 PPI 的抑制活性 (n = 1)。 (D) KRAS-AP8784 复合物的整体结构，叠加在 SOS1 催化 HRAS 复合物结构上 (PDB 代码：4NYJ，变构 RAS 未显示)。KRAS、HRAS 和 SOS1 分别用黄色及浅灰/深灰色丝带表示，AP8784 以橙色棒模型显示。 (E) GDP-KRAS-G12D（黄色）与 AP8784（橙色）的相互作用表面。AP8784 的环状骨架上多个点与 KRAS 的 Gln99 残基（绿色）相互作用，形成“轮轴”样结合构象。
图9｜LUNA18 作为临床 RAS 抑制剂 (A) LUNA18 的化学结构。 (B) 对癌细胞系的细胞生长抑制活性。细胞活力通过 CellTiter-Glo 测定（平均值 ± SD, n = 6，红色；KRAS 依赖细胞系，蓝色；KRAS 非依赖细胞系）。NCI-H2122（KRAS-G12C）；MiaPaCa-2（KRAS-G12C）；NCI-H441（KRAS-G12V）；LS 180（KRAS-G12D）；GSU（KRAS-G12D）；T-47D（KRAS-WT，激素依赖）；A-375（KRAS-WT，BRAF 依赖）。 (C) LUNA18 对 NCI-H441（KRAS-G12V）中 KRAS 信号通路的影响，细胞用所示浓度的 LUNA18 处理 4 小时。 (D, E) LUNA18 在 NCI-H441 异种移植模型中的抗肿瘤活性，该模型每天口服 LUNA18 14 天。测量各组的肿瘤体积和体重变化。数据以平均值 ± SD 表示（n = 8）。肿瘤体积的统计分析采用 Steel 检验 [**p < 0.01 与载体组比较，空圆圈表示载体，实心圆圈；3 mg/kg LUNA18，空方块；5 mg/kg LUNA18，实心方块；10 mg/kg LUNA18]。 (F) LUNA18 对 NCI-H441 异种移植模型中 KRAS 信号通路的影响，该模型每天口服 LUNA18 7 天。肿瘤（n = 3）在最后一次给药 4 小时后切除。 (G) LUNA18 的药代动力学参数。数据以平均值 ± SD 表示，*表示三只动物,**表示四只动物。
LUNA18 能够进入细胞和体内肿瘤并产生强效作用。5 种 KRAS-G12X 细胞系的增殖被 LUNA18 有力抑制，$ IC_{50} $ 为 0.17-2.9 nM。依赖不同于 RAS 信号的 T-47D 和 A-375 对 LUNA18 不敏感。使用 NCI-H441（KRAS-G12V）细胞进行的信号分析显示，LUNA18 以浓度依赖方式降低 GTP-KRAS、pERK1/2 和 pAKT；在 100 nM 时未检测到 GTP-KRAS。这些结果提示 LUNA18 是选择性 RAS 抑制剂。在 NCI-H441 小鼠异种移植模型中，每日一次口服给药 LUNA18，剂量最高 10 mg/kg，可产生剂量依赖性抗肿瘤活性，且未出现明显体重下降。此外，每日一次口服给药 7 天后，GTP-KRAS、pERK1/2 和 pAKT 的下降也得到确认。在 MIAPaCa-2（KRAS-G12C）小鼠异种移植模型中，也确认了类似抗肿瘤活性。
LUNA18 作为口服 RAS 抑制剂的人体 1 期临床研究正在进行。口服给药后，LUNA18 在小鼠、大鼠、猴和犬中的生物利用度分别为 21%、22%、26% 和 47%。在 Eurofins CEREP 提供的 132 个靶标体外药理学评估中，10 μM LUNA18 条件下，NK2（69% 抑制）和 Cl-channel（53% 抑制）显示不低于 50% 的抑制。132 个靶标中仅有 2 个在约 10 μM 处出现脱靶抑制，说明脱靶毒性风险可能与小分子相似。考虑到肿瘤细胞 $ IC_{50} $ 低于 3 nM（超过 1000 倍差距），治疗窗被评估为足够大。
3 讨论
确定了环肽具有药物化特性所需的若干关键因素。尽管环孢素通常被认为是中等分子量且具有极佳药物化特性的分子，环肽作为药物模式在针对细胞内靶点的药物发现中仍具有一般性优势。值得注意的是，分子量较小的肽不一定药物化特性更好：例如，11残基肽相比8残基肽更有可能满足药物化标准。通过整合膜透过性与代谢稳定性的研究首次揭示了这一最佳残基数。该现象可通过以下假设解释：11残基肽如环孢素结构上比8残基肽更柔性，在疏水性膜中可形成更疏水的构象，而在水中可通过较亲水的构象抑制氧化代谢。由于研究中的11残基肽在水中呈亲水构象，其水溶性可接受（例如，LUNA18在空腹状态模拟肠液中的溶解度为17.8 μg/mL）。疏水肽的可接受水溶性为该假设提供支持，但尚未获得实验验证，计划在未来研究中进行。研究中还使用了丰富的序列多样性，尤其是N-烷基化模式，以阐明药物化肽的标准，这与仅使用特定序列的相关研究不同，使提出的环肽药物化标准具有更广泛适用性。通过对700多种化合物的膜透过性或代谢稳定性进行系统评估，研究揭示了若干关键趋势，并提出了环肽药物化标准，期望在未来进一步完善。
针对11残基环肽提出的药物化标准可推广至其他长度的环肽：1.Clog P/残基数 ≥1.17；2.N-烷基化比例 ≥0.5。其中，Clog P/残基数用于衡量不同残基数下的疏水性。应用该标准，分别有33%（5/15）、67%（67/100）和43%（3/7）的10、11和12残基肽符合药物化标准。
利用mRNA展示文库建立命中肽筛选平台存在技术挑战，主要包括：1. 现有肽环化方法未完全满足代谢稳定性要求；2. 药物化标准要求高NAA含量，导致肽翻译效率下降；3. 肽长度受限且氨基酸侧链多样性较低，限制靶蛋白结合选择。从指定文库中富集的环肽含有6–9个非天然氨基酸（NPA），其中11残基肽含5–7个天然氨基酸（NAA），其含量在相关研究中处于最高水平，并具备药物化肽的特点，包括肽长度、官能团类型和NAA数量，但疏水性不在其中（与文库平均值对比见表1）。部分离子官能团如羧酸和烷基胺有利于结合，可通过在文库中包含极性氨基酸并在后续衍生化步骤中去除来提升命中率。但文库未包含这些极性氨基酸，因为在先导优化中，当它们对结合起关键作用时，替换为非极性氨基酸会非常困难，这在小分子药物发现中已被广泛认识。值得注意的是，即使未包含极性官能团，获得的命中肽仍能结合至与KRAS结合的极性肽相同的结合表面，表明AP8784的非极性残基能够替代极性肽与KRAS之间的离子相互作用。肽长度或NAA数量的剧烈变化也可能显著改变主链结构，从而导致活性大幅下降。另一方面，基于小分子药物发现的经验，改善疏水性相对可行，通常通过侧链修饰而非主链结构调整实现。因此，临床候选肽可通过保持命中肽Clog P略低于药物化肽标准而在不改变构象的前提下实现递送。
单次增加或减少NAA或修改N-烷基化模式会影响膜透过性。基于316个11残基模型肽（6个及以上N烷基化，0–2个羟基，无离子官能团）的评估分析了不同N-烷基化模式对药物化特性的影响。尽管几乎所有N-烷基模式的hLM $ CL_{int,mic} $均可接受，但29/46种模式（63%）的Caco-2 $ P_{app} $较高（≥50%肽符合Caco-2标准），17种模式在Clog P ≥12.9的情况下表现出较低Caco-2 $ P_{app} $。较高疏水性仍重要，同一N-烷基模式下疏水性较高的肽通常Caco-2 $ P_{app} $也较高。样本有限，但单次增加或减少NAA或N-烷基化模式变化造成的透过性差异可被识别，类似序列间存在显著差异，这可能是由于肽在膜中形成疏水构象的易行性所致。观察表明，当通过侧链修饰无法获得膜透过性时，部分N-烷基模式调整可能是一种可行方法。
图10｜LUNA18 与 AP8784 在 KRAS 结合形式下的叠加 LUNA18 (PDB ID 7YVI) 以青色显示，AP8784 (PDB ID 7YUZ) 以橙色显示。叠加基于对应的 11 个 Cα 原子进行。AP8784 与 LUNA18 的主链重叠良好。
文库中的命中肽AP8784可在不显著改变骨架结构的情况下生成临床候选肽LUNA18，验证了该策略的有效性。侧链修饰增加疏水性（Clog P）和结合亲和力，在C端四个残基中增加一个NAA并重新排列N-烷基模式，AP8784与LUNA18主链重叠良好，11个Cα原子RMSD为0.3 Å，4号与6号顺式酰胺键位置未改变。结果表明，高度N-烷基化的11残基环肽骨架较刚性，可在不影响活性的前提下通过单次增加NAA和修改N-烷基模式改善膜透过性，为命中肽的先导优化提供有效方案。
中分子药物发现有望在未来实现快速发展，类似于小分子药物在高通量筛选技术发展和Lipinski提出Ro5原则后取得的增长。一旦获得期望的命中肽，识别临床候选化合物相对直接，可避免对骨架进行剧烈修饰，这与遵循Ro5的小分子药物发现类似。这一新方法相比以往方法具有明显优势。此前，中分子肽作为口服药物的开发成功有限，可能是由于缺乏统一的命中肽筛选和先导生成标准。提出的环肽药物化标准已被用于设计文库以筛选针对细胞内靶点的命中肽，并促进其优化为临床候选化合物。这些标准预计将在未来通过更广泛的研究进一步优化。在命中肽生成中面临的挑战，如高N-烷基化要求和环状骨架结构限制，已通过翻译组件工程得以克服。