iScience 2026 | DeepDE: 用迭代深度学习推动定向蛋白进化
今天介绍的是一篇关于深度学习辅助蛋白优化的论文。该工作针对蛋白活性优化中实验验证不足、迭代评估缺失和数据稀疏等问题，提出 DeepDE 算法，以三突变体为构建单元，并用约 1,000 个突变体组成的紧凑训练库指导设计。在维多利亚多管发光水母 GFP 上，结合有限筛选的迭代路线在四轮进化后将活性提升 74.3 倍，超过经典 superfolder GFP。结果表明，实验上可承受的小规模筛选能显著提升 AI 引导蛋白工程的稳定性和实用价值。
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0 摘要
深度学习已迅速成为蛋白优化中很有前景的工具箱，但其成功仍然有限，尤其是在活性优化方面。此外，多数算法缺乏严格的迭代评估，而这正是经典定向进化所代表的蛋白工程关键环节。于是提出 DeepDE，一种稳健的深度学习引导迭代算法，以三突变体作为构建单元，并使用约 1,000 个突变体组成的紧凑文库进行训练。与每轮使用单突变或双突变相比，三突变体能够探索大得多的序列空间。将 DeepDE 应用于维多利亚多管发光水母 GFP 后，经过四轮进化实现了 74.3 倍的活性提升，显著超过基准 superfolder GFP。结果提示，包含约 1,000 个变体、实验成本可承受的有限筛选能够显著增强 DeepDE 的性能，其原因可能是缓解了蛋白工程中难以处理的数据稀疏问题所带来的限制。
1 引言
蛋白工程是推动生物技术应用发展的基础驱动力，覆盖工业、医学和农业等重要领域。然而，目标蛋白的序列空间极其庞大。例如，一个平均含有 300 个残基的蛋白，仅三个位点发生替换就可能产生约 3.1 × $ 10^{10} $ 种组合。如此巨大的组合复杂度，对目标蛋白功能景观的探索构成严峻挑战，并严重阻碍蛋白工程实践。
蛋白工程的经典方法是定向进化，通常包含三个关键步骤：为目标蛋白生成随机突变文库，筛选数千个突变体以寻找功能提升的变体，并选择表现最佳的变体作为下一轮进化模板。尽管这种迭代过程比理性设计更强大，却往往劳动密集、耗时且效率不高。近年来，人工智能，尤其是深度学习，已迅速成为蛋白优化中很有前景的工具箱。目前，领先的 AI 引导蛋白工程算法利用在不同蛋白数据集上训练的模型，并使用表现靠前的模型预测定量功能。训练方法大致可分为无监督学习、弱阳性数据学习和监督学习。无监督学习利用大规模、多样化且无标签的序列数据集，例如 UniRef，从超过 2,000 万条蛋白序列中提取一般特征。弱阳性数据学习利用数量有限、进化上相关但缺乏实验测定适应度标签的蛋白集合；主动学习除外，其模型从少量有标签样本开始，逐步为额外无标签数据查询标签，并将其纳入训练数据集。相比之下，监督学习使用特定目标蛋白的变体序列及其适应度标签进行训练。
迄今为止，AI 引导蛋白工程的成功仍然有限，尤其是在活性优化领域。仍有两个关键障碍。第一，许多方法缺乏稳健的实验验证，主要依赖同分布测试，即训练数据和测试数据来自同一个数据集。这类测试本质上是插值性的，在处理蛋白工程这类需要外推的复杂生物学问题时可能产生误导。第二，极少有方法被置于迭代框架中实施，而迭代恰恰是蛋白工程经常需要的关键特征，经典蛋白定向进化便是如此。
例如，近期提出的 EVOLVEpro 算法结合主动学习与随机森林，但在每个设计周期中只生成单点突变，本质上缺乏迭代能力。另一个典型例子是 low-N 算法，该算法采用岭回归，并应用于维多利亚多管发光水母绿色荧光蛋白 avGFP；该蛋白由 238 个氨基酸组成。在监督学习阶段仅使用 24 个 avGFP 变体的情况下，该算法引入半径为 7 或 15 的突变，并且同样只在单个设计周期中评估。虽然报告了若干显著改进的突变体，但排名前 100 的突变体中有 77 个携带位于著名发色团位点 S65 的突变，这一比例异常偏高。已知单独的 S65T 可使 GFP 活性提高 4 至 6 倍。随机选择其中四个突变并将 S65 位点恢复为野生型后，四个突变体的活性均回到野生型水平。这里利用三类深度学习方法，即无监督学习、弱阳性数据学习和监督学习，设计出 DeepDE 算法。该算法包含三个关键特征。第一，使用由 1,000 个单突变体或双突变体组成的监督训练数据集。第二，每一轮进化将突变半径设为三。该半径带来显著挑战，因为它会产生约 1.5 × $ 10^{10} $ 个变体的组合文库，而双突变体约为 1.0 × $ 10^{7} $ 个，单突变体约为 4.5 × $ 10^{3} $ 个。如此庞大的变体数量超过了计算建模和实验筛选的实际极限。同时，选择这一半径也可缓解更大半径下更庞大理论突变空间带来的探索困难。更关键的是，该半径允许使用标准诱变试剂盒，基于下文概述的预测三突变位点，在实验上探索一组聚焦突变体。第三，实施两种设计策略：直接预测诱变方法，即直接预测具有特定氨基酸替换的有益三突变体；以及诱变结合筛选方法，即先预测潜在有益的三突变位点，再在实验中构建 10 个三突变体文库进行筛选，以识别最佳突变体。这使得三条由这两种方法组成的进化路径能够被评估，包括仅直接预测、筛选后直接预测，以及仅筛选。
作为概念验证，选择 avGFP 作为模型蛋白。实施了跨越五轮的迭代进化循环。前四轮使用同一个训练数据集，以探索该数据集可达到的优化程度；第五轮则转向另一个训练数据集。在三条进化路径中，只有路径 III，即仅筛选路径，持续呈现最有希望且稳步提升的结果，优于路径 I，即仅直接预测路径，以及路径 II，即筛选后直接预测路径。将 superfolder GFP 中已知的 S65T 突变与路径 III 结合后，在第四轮获得了表现最佳的突变体，活性提高 74.3 倍，显著超过 sfGFP 的 40.2 倍提升；后者来自多年工程化改造。
2 结果
2.1 模型蛋白 GFP 的选择
作为概念验证，选择 avGFP 作为模型蛋白。为此，对可用于训练和进化的蛋白突变体文库进行了广泛调研。这些文库通常分为两大类。第一类是深度突变扫描文库，其中目标蛋白的每个位点被突变为特定氨基酸，例如丙氨酸，或突变为其他 19 种替代氨基酸中的每一种。然而，前一种方法过于受限，后一种方法成本可能过高。第二类是随机文库，其中目标蛋白的整条序列通过易错 PCR 发生突变。由于这类文库成本更可承受，因此决定利用随机文库，并最终选择经过精心整理的 avGFP 文库用于分析。
2.2 GFP 的深度学习引导定向蛋白进化计算评估
采用两项评估指标：实际值与预测值之间的 Spearman 秩相关系数，以及归一化折损累计增益 NDCG，后者会对准确预测高适应度结果赋予更高分数。为了评估模型性能，使用六组单突变体或双突变体数据，并按 1/9 的比例划分，样本量分别为 24、96、240、400、1,000 和 2,000。随后在 Sarkisyan 数据集的全部三突变体上评估训练后的模型，共计 12,337 条序列，从而提供更严格的分布外测试。可以观察到，算法性能与训练数据集大小呈正相关，Spearman 相关系数从 0.30 提高到 0.74，NDCG 值从 0.34 提高到 0.81。这些结果强调了数据规模对于提高监督学习蛋白设计能力的重要性。基于这一发现，选择包含 1,000 个突变体的数据集用于 GFP 的模型训练和设计。
为了考察数据集组成对模型性能的影响，在保持突变不变的情况下，改变训练数据集中单突变体与双突变体的比例，从 1/9 调整到 9/1。有趣的是，DeepDE 预测出同一组三突变体结果。这提示训练数据集中双突变体的有限代表性，即在 10,181,283 种可能双突变中仅有 900 个，约占 0.009%，很可能不足以为模型提供额外信息。非常有意思的是，当训练后的算法在剩余双突变体上评估时，得到的两个性能指标分别较低，为 0.58 和 0.74。这一结果与实验数据一致。
2.3 GFP 的设计与验证
随机选择的 1,000 个突变体训练数据集及其对应活性分布显示，这些突变体覆盖 avGFP 238 个位点中的 219 个。由于计算所有可能的三突变体成本很高，约为 1.5 × $ 10^{10} $ 个，因此采用两种方法寻找有益三突变体。对于直接预测方法，计算所有可能的双突变体，并识别预测活性高于野生型 125% 的 258 个顶级突变体。随后计算每个位点的突变频率，选择前 20 个突变位点及其对应氨基酸替换。通过考虑双突变体的所有子集组合生成三突变体。训练后的 DeepDE 模型用于预测每个三突变候选体的活性，并选择排名前 10 的三突变体进行直接合成和测定。
对于筛选方法，模拟所有可能双突变体的景观，预测全部双位点组合的活性值，共 28,203 种组合，即$ C ^{2} _{238} $，并计算每个位点组合中排名前三突变体的平均活性。对于每个三位点组合，共 2,218,636 种组合，即 $ C ^{2} _{238} $，计算对应双位点组合的平均值，并选择排名前 10 的三位点组合。随后用训练后的 DeepDE 模型预测这些前 10 个组合对应的全部三突变体活性值。排名前 5 的突变体被选择用于简并密码子编码，并使用 GeneArt Site-Directed Mutagenesis PLUS Kit 进行实验验证。每个周期筛选约 1,040 个三突变体。直接设计并合成的序列，以及使用诱变试剂盒构建的序列文库，均克隆到携带 pACYC184 质粒的大肠杆菌 $DH5 _{α}
2.4 GFP 的第一轮进化
排名前 10 的预测序列在两个激发波长下，即 398 nm 和 488 nm，均表现出高于野生型的荧光强度，命中率达到 100%。活性最高的突变体 DM1，即 R73H/V163G/D190N，在 $ GFP_ {488nm} $活性上提高 2.1 倍，在 $ GFP_ {398nm} $ 活性上提高 1.7 倍。随后预测排名前 10 的三位点组合，并构建 10 个组合突变文库。在组合文库中，1,003 个克隆中有 436 个在 $ GFP_ {398nm} $ 荧光强度方面高于野生型，命中率为 43.5%； $ GFP_ {488nm} $ 活性的命中率为 34.9%。活性最高的突变体 SM1，即 E5N/R73H/V163G，在 $ GFP_ {488nm} $ 活性上提高 2.1 倍，在 $ GFP_ {398nm} $ 活性上提高 1.8 倍。值得注意的是，前十个设计序列中只有一个也出现在前十个筛选序列中。
接下来，使用同一训练数据集挑战 ECNet。ECNet 是另一种监督学习模型，结合双向长短期记忆网络 BiLSTM 和自注意力机制，通过利用一般蛋白进化背景来预测特定蛋白中的诱变效应。同样要求输出排名前 10 的预测序列，以及用于构建并筛选最佳突变体的前 10 个三位点组合。ECNet 预测的 10 个序列在两个激发波长下，即 398 nm 和 488 nm，表现均较差，命中率为 0%。对于 ECNet 产生的组合突变文库，1,038 个克隆中仅有 104 个在 $ GFP_ {488nm} $ 活性方面高于野生型，命中率仅为 10.0%； $ GFP_ {398nm} $ 活性的命中率为 8.3%。活性最高的突变体 Q157T/K162S/K214L，在 $ GFP_ {488nm} $ 和 $ GFP_ {398nm} $ 活性上均仅有 1.2 倍的温和提升。总体而言，DeepDE 有力展示了预测高适应度突变体的潜力，并显著优于 ECNet。
2.5 GFP 后续三轮迭代设计与验证
以 DM1 和 SM1 作为两个独立路径的模板，即路径 I 或仅直接预测路径，以及路径 II 或筛选-直接预测-直接预测-直接预测路径，继续利用同一个训练数据集，通过直接设计方法开展另外三轮迭代进化。对于两条路径，每轮最佳突变体都作为下一轮模板。路径 I 的 $ GFP_ {488nm} $ 活性在第三轮达到峰值，提升 4.7 倍；路径 II 的 $ GFP_ {488nm} $活性持续上升，到第四轮达到 7.6 倍提升。
鉴于路径 II 优于路径 I，进一步探索额外的有限筛选是否可在 SM1 基础上带来更高程度优化。为此建立第三条路径，即路径 III 或筛选-筛选-筛选-筛选路径，再次使用同一个训练数据集，并进行另外三轮组合文库构建。路径 III 持续优于路径 II，到第四轮实现了令人瞩目的$ GFP_ {488nm} $活性 25.8 倍提升。值得注意的是，PIII-3 含有一个额外突变 G4S 和一个同义突变 E90。由于使用寡核苷酸构建组合文库时可能发生此类错误，因此这一结果被视为可接受。此外，将 S65T 突变引入路径 III 各轮中表现最好的突变体后，最佳突变体 PIII-4 的 $ GFP_ {488nm} $活性达到 74.3 倍提升，显著超过 sfGFP 的 40.2 倍提升。
作为比较，还将 S65T 突变整合到路径 I 和路径 II 各轮中表现最好的突变体中。路径 I 的最佳突变体 PI-3 在 $ GFP_ {488nm} $活性上提高 17.6 倍，路径 II 的最佳突变体 PII-2 提高 23.4 倍。另开展了一条使用双突变体作为构建单元的短进化路径 PIa，共两轮。在该方法中，计算所有可能的有益双突变体，并选择前 10 个序列进行直接合成和测定。随后将最佳突变体作为第二轮设计和测定模板。该路径得到的突变体表现最低， $ GFP_ {488nm} $活性仅提高 2.7 倍。该结果与 DeepDE 在 GFP 双突变体上的计算评估一致，因此放弃这条进化路径。总之，对于 GFP，额外的有限筛选显著增强了 DeepDE 的性能，凸显其优化蛋白变体的潜力。
图1｜DeepDE 与 ECNet 在第一轮设计中的 avGFP 突变体活性 (A) DeepDE 直接预测的前 10 个突变体的$ GFP_ {398nm}
2.6 使用新训练数据集开展 GFP 的第五轮也是最终轮设计与验证
在最终设计轮次中，为三条独立路径，即路径 I、路径 II 和路径 III，分别选择一组新的 1,000 个单突变体或双突变体。这些突变体集合分别覆盖 avGFP 238 个位点中的 222、209 和 224 个。三条路径中的三个最佳突变体 PI-5、PII-5 和 PIII-5，在$ GFP_ {488nm} $活性方面均略优于 PI-4、PII-4 和 PIII-4。引入 S65T 后进一步增强了 PI-5、PII-5 和 PIII-5 的 $ GFP_ {488nm} $活性，分别达到 9.0 倍、22.7 倍和 64.0 倍提升。然而，就 $ GFP_ {488nm} $活性而言，引入 S65T 的 PIII-4 仍是活性最高的变体。
3 讨论
提出了一种用于蛋白进化的深度学习引导算法，并在 GFP 上进行了评估。结果显示，与 low-N 算法的主张相反，将训练数据集扩展到实际可行的规模，即约 1,000 个变体，可显著提升 DeepDE 的理论性能指标。这一改进在概念上合理，原因有二。第一，蛋白高度多样，每种蛋白或蛋白家族都具有不同的结构与功能属性。第二，组合突变空间本身极其庞大，带来严重的数据稀疏挑战，使低样本量训练数据集很难实现泛化。
图2｜来自三条不同进化路径的 DeepDE 结果 显示了通过 Path I（PI）、Path II（PII）和 Path III（PIII）获得的前 10 个突变体的$ GFP_ {488nm} $活性倍数变化，以及在引入 56T 后来自 Path III 的前 10 个突变体（记为 56T）。所有实验均进行了三次生物学重复。误差条（范围从 0.13% 到 2.73%）过小，无法在图中清晰显示。
在突变半径为三的直接对照设计与测试中，DeepDE 展现出很强的稳健性。直接预测诱变模式的命中率达到 100%，诱变结合有限筛选模式的命中率达到 43.5%，远超比较算法 ECNet。进一步迭代测试显示，与单纯依赖直接预测相比，DeepDE 与有限筛选结合时可产生显著更好的结果。在短短四轮进化中，利用由 1,000 个变体组成的紧凑训练数据集，并在每个周期筛选约 1,000 个突变体的适中筛选文库，总计 4,000 个，DeepDE 得到表现最佳的突变体 PIII-4 加 S65T，其活性几乎达到标志性 sfGFP 的两倍。有趣的是，在 PIII-4 加 S65T 的 12 个突变中，除 S65T 外，只有三个位点 V163、I171 和 A206 与 sfGFP 重叠；sfGFP 则携带 14 个突变。该突变体还优于近期报道的 sfGFP 变体 mChartreuse，后者整合了来自另外两个 avGFP 突变体的六个额外突变，并表现出$ GFP_ {488nm} $活性 66.6 倍提升。
重要的是，在必须转向第二个训练数据集之前，该突变体已经出现，因为其活性已经超过 sfGFP。路径 III 下一轮使用第二个训练数据集得到的最佳突变体 PIII-5 加 S65T，实际表现略差。这一观察提示，DeepDE 可能已经快速接近 avGFP 的$ GFP_ {488nm} $活性上限。不过，这种效率是 GFP 特异性的，还是也可在具有不同进化景观的蛋白中实现类似表现，仍有待确定。
为 AI 引导蛋白进化提供了两个关键见解。第一，有限筛选显著提升 DeepDE 的性能。这很可能源于深度学习模型在针对特定蛋白的中等规模突变体数据集上训练时能力有限，难以有效穿越广阔且可能独特的目标蛋白突变景观。有限筛选为算法提供了更多样的轨迹，使其能够更灵活地穿越蛋白景观，从而缓解蛋白工程中数据稀疏带来的严峻挑战。随着自动化工作站的发展，有限筛选正变得越来越可行。第二，路径 III 即仅筛选路径与有限筛选相结合，活性曲线持续上升；而路径 I 即仅直接预测路径，以及路径 II 即筛选后直接预测路径，从第二轮开始均依赖直接预测，其活性曲线早在第二轮就开始趋于平台，路径 I 甚至随后下降。这一观察强烈提示，蛋白工程算法性能必须以迭代方式评估，而这一关键问题在当前文献中仍未得到充分解决。
对于目前缺乏可用突变体训练数据集的蛋白，DeepDE 可采用一般化流程。第一，使用易错 PCR 在单个批次中生成有限的单突变体或双突变体文库，规模为数千个，并按一致标准整理，用于多轮进化。第二，选择约 1,000 个突变体训练 DeepDE 模型，计算三位点组合，并据此在实验上构建约 1,000 个突变体的有限组合文库。第三，选择最佳突变体作为出发点，继续设计和筛选下一个表现最佳的突变体。如有必要，可切换到新的训练数据集。总体而言，DeepDE 算法与这里概述的有限筛选相结合，为 AI 引导蛋白工程提供了更务实且可扩展的方法。显然，算法仍可进一步优化，尤其是通过更新无监督学习模型、弱阳性数据学习模型，以及设计更好的迭代进化策略来实现。