Chemical Reviews 2026: 膜活性抗菌多肽的结构、相互作用与组装 (上)

今天介绍的是发表在 Chemical Reviews 上的一篇综述,主题聚焦膜活性抗菌多肽的结构,相互作用与组装。随着细菌耐药性不断加剧,传统抗生素面临越来越大的挑战,抗菌肽因能够直接作用于微生物膜而受到广泛关注。文章从AMPs的发现与分类出发,进一步讨论其膜选择性,膜破坏机制以及常用模型膜体系,梳理了多肽与脂质膜相互作用中的关键分子事件,也展示了生物物理技术在解析这一复杂过程中的重要作用。

Lee, T.-H.; Charchar, P.; Sani, M.-A.; Le, D.-H.; Le, T. C.; Yarovsky, I.; Separovic, F.; Aguilar, M.-I. Structure, Interactions, and Assembly of Membrane-Active Antimicrobial Polypeptides. Chem. Rev. 2026. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.5c00994.

0 摘要

抗菌肽(AMPs)正在成为潜在的抗菌药物,以应对细菌对传统抗生素耐药性迅速增加的问题。这类多肽主要靶向微生物膜,其作用机制可由多种模型加以描述,通常会导致细胞内容物释放和膜结构破坏,最终引发细胞死亡。AMPs与靶膜之间的相互作用对其特异性和活性至关重要。然而,在不同生物体中,AMP结构与其细胞溶解功能之间的精确关系仍未得到充分阐明。

该领域的挑战在于AMPs与细胞膜相互作用本身十分复杂,而且不同AMP类别之间的作用机制存在显著差异。生物物理技术被广泛用于研究肽结构和膜性质如何影响模型膜体系中的AMP细胞溶解活性,近年来也逐渐应用于活细胞研究。在这篇综述中,作者讨论了用于研究膜破坏机制的高分辨率技术,并介绍这些技术如何为AMPs提供结构和功能层面的认识。文章旨在汇集实验方法和理论建模方法,用于表征AMPs的折叠过程及其相互作用,从而协同推动新一代有效抗菌治疗药物的发展。

1 引言

1.1 AMPs的发现与分类

膜活性肽能够与膜相互作用,并表现出多样的作用方式,包括破坏膜结构,穿越膜,停留在膜表面,以及整合进入膜中。在这些膜活性肽中,抗菌肽(AMPs)由于全球公共卫生问题以及抗微生物耐药性(AMR)的发展而受到基础研究和药物开发领域的高度关注。AMR会导致死亡率上升,并带来更高的社会经济成本。

1922年,Alexander Fleming在多种人体生理体液以及动物组织中发现了第一种可溶性抗菌物质,即溶菌酶。溶菌酶对广谱细菌表现出杀菌和抑菌活性。1928年,Fleming随后从绿色霉菌Penicillium notatum的培养物中发现了青霉素,该物质能够抑制多种细菌的生长。此后,Howard Florey和Ernst Chain在20世纪40年代成功推动了青霉素的治疗应用。

然而,第一个AMP是gramicidin A’,最初由Rene Dubos于1939年从土壤细菌Bacillus brevis的培养上清液中提取并鉴定。后来研究显示,gramicidin A’对多种革兰氏阳性菌的杀菌和抑菌活性来自6种相似AMPs的混合物。这些AMPs也是最早被完整测序的AMPs,其结构为N-甲酰化多肽,并具有交替排列的L-和D-氨基酸。由于gramicidin A’能够快速有效地用于伤口消毒,它成为第一种商业化生产并用于局部治疗的AMP。

此后,AMPs从广泛来源中被分离出来,并被证明具有多种生物活性。AMPs也可以根据二级结构和三级结构进行分类,或者依据特定氨基酸组成和化学修饰进行划分。此外,围绕AMPs对膜的作用方式,其活性已经得到了广泛研究。

AMPs是先天免疫系统抵御微生物的第一道防线,可由中性粒细胞和上皮细胞分泌,存在于多种组织和体液中。AMPs对多种病原体具有高度特异性和活性,并表现出广谱杀微生物作用,涵盖革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌以及分枝杆菌。截至2025年9月,抗菌肽数据库(APD6)中收录了5722种具有抗菌活性的肽。

图1｜抗生素,AMPs耐药性以及抗菌数据库发展的时间线。

与青霉素等非核糖体合成化合物不同,后者通常靶向特定代谢途径或合成途径,AMPs主要通过结合微生物细胞膜并破坏膜结构,或跨膜转位来发挥作用。迄今为止,大多数已表征的AMPs都带有净正电荷,这使其能够结合带负电荷的细菌膜。在界定AMP膜破坏机制时,越来越多的证据表明,目前广泛接受的环形孔模型和地毯模型过于简化。现在已有约20种分子模型被提出,用于描述AMPs的作用方式。

虽然AMPs耐药性可能比传统抗生素耐药性更少见,但目前已经明确了多种适应性耐药机制。相关综述系统介绍了多种耐药途径,包括蛋白水解降解,外排系统,以及由PmrA-PmrB和PhoP-PhoQ双组分系统介导的脂质A修饰。移动性黏菌素耐药基因(mcr)的出现,进一步使多黏菌素耐药性转变为一种可水平转移的性状。目前已经记录到10种全球分布的mcr变体,其中mcr-9和mcr-10的传播模式尤其令人担忧。

与此同时,研究也发现了限制耐药进化的重要因素。例如,综合进化分析表明,某些AMPs,如tachyplesin II,表现出有限的耐药进化能力,并且相对简单的物理化学特征会显著影响细菌的可进化性。

目前,仅约39%的AMPs具有已表征的三维结构,这些结构主要通过溶液核磁共振(NMR)波谱学测定。多个AMP数据库已经建立,但其中收录的肽数量以及代表性二级结构比例差异很大。例如,根据抗菌肽数据库(APD6),16.5%的AMPs被预测为螺旋结构,2%为β链结构,2.3%为混合结构。相比之下,更新后的抗菌肽集合数据库(CAMP)包含682个高分辨率AMP结构,其中18.7%为α螺旋结构,18.9%为β链结构,60.1%为混合结构或共结构。因此,目前只有少部分AMPs具有高分辨率结构信息,而其中多数为α螺旋结构。

图2｜AMPs的分类。 天然AMPs的多样性可基于以下方面进行分类:(a)来源;(b)对微生物和细胞的活性;(c)特定氨基酸组成或非核糖体酶促修饰;(d)二级结构/三级结构;(e)作用方式,包括作用于膜或非膜结构,靶向细胞内分子(蛋白质,DNA/RNA),或刺激宿主免疫反应。

1.2 生物膜组成与结构

哺乳动物细胞膜和细菌细胞膜在关键结构和化学组成上存在差异,这些差异调控它们与AMPs之间的相互作用。哺乳动物细胞质膜外层主要由两性离子型甘油磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)组成,而内层则富含甘油磷脂酰乙醇胺(PE),甘油磷脂酰肌醇(PI)和甘油磷脂酰丝氨酸(PS),因此整体呈净负电荷。相比之下,细菌细胞具有复杂的包膜结构,革兰氏阳性菌具有细胞壁,革兰氏阴性菌则具有致密的脂多糖(LPS)层,这些结构保护着细胞膜。细菌膜中含有不同比例的带负电荷和中性甘油磷脂,尤其是甘油磷脂酰甘油(PG),心磷脂(CL)和PE。

表1｜APD6(抗菌肽数据库)中抗菌肽的结构类别与统计信息。

因此,常有人认为AMPs对细菌膜的选择性仅仅取决于膜表面电荷。然而,除头基种类不同之外,脂质尾链长度,饱和程度,酰基链中的支化或环化也存在显著差异,这意味着不同细菌的膜在厚度,流动性和弯曲模量方面各不相同,而这些性质都会影响其与AMPs的相互作用。此外,哺乳动物和细菌的细胞膜都并非均一结构。细胞膜包含组成不同的局部区域,这些区域会随细胞类型,细胞生命周期以及生物体状态而变化,并且在细菌中还会随着生长阶段而改变,不同区域也会受到AMPs的差异性攻击。

1.3 膜破坏机制

尽管目前已经对抗菌肽和细胞溶解肽作用机制的分子基础有了一定认识,设计具有窄谱活性的新型多肽仍然是一项重大挑战。这在很大程度上源于细菌细胞和哺乳动物细胞的主要作用靶点本质相同,即膜脂质组装体。鉴于脂质结构和组成具有极大的多样性,要将多肽精确设计为作用于特定膜系统,仍然难以实现。宿主毒性通常通过溶血活性来定义,但红细胞的易感性不能简单推广到其他动物细胞,即使在哺乳动物不同物种之间也可能存在显著差异。

在早期研究中,研究者曾试图建立AMPs作用的通用机制。现在已经明确,AMPs并不存在一种普遍适用的作用方式。为解释AMPs与膜相互作用过程中发生的分子变化,并开发针对耐药菌的有效治疗方法,已有大量关于AMPs膜作用机制的模型被提出。然而,在许多情况下,即使是序列相同或相近的多肽,也会被提出不同的作用机制。造成这些矛盾的因素有很多,包括采用的技术不同,膜结构和物理性质的变化,而这些变化又在很大程度上取决于多肽浓度(膜结合多肽/脂质比例),脂质组成(膜表面电荷),以及脂质分子的组织方式(脂质相态/有序性)。

图3｜AMP结合脂质膜并与其相互作用的一般机制示意图,以及介导该相互作用的关键性质。

此外,由于静电相互作用是阳离子AMPs最初结合细菌膜中阴离子脂质的主要驱动力,天然环境中的许多非特异性相互作用都可能影响多肽的靶向性和活性。事实上,膜内和膜周围密集分布着多种分子,这些分子具有带电界面和疏水界面,但以目前的高分辨率技术显然难以追踪这类相互作用。最后,某种特定作用方式还可能引发下游级联反应,从而阻碍生理过程。例如,AMPs可能通过靶向细胞分裂过程中与膜内陷相关的分裂体蛋白复合物,阻断细胞分裂。

大多数已报道的AMPs带有净正电荷,这使其能够通过静电作用结合带负电荷的细菌膜,进而诱导其发生结构转变,形成两亲性二级结构,并扰乱脂质膜的堆积方式(图3)。通常有两类概念上不同的机制被用来解释其细胞溶解活性。一类机制认为,多肽穿入膜中,以“桶板式”或“环形孔”排列形成孔道;另一类机制认为,多肽聚集在膜表面,并在膜中造成损伤,即“地毯”机制。在这两种情况下,细胞死亡都源于电化学梯度丧失,随后发生细胞裂解。尽管这些模型被广泛接受,但越来越多的证据表明,这类模型过于简化。如今已有约20种分子模型被提出,用于描述AMPs的作用方式,下文将对此进行讨论。

图4｜用于研究AMP-膜相互作用的生物物理技术。 图中根据检测和分析的物理基础对这些技术进行了分类。

1.4 研究AMP介导的生物膜破坏的技术

AMP-膜相互作用具有高度动态性,阐明AMP,脂质膜以及AMP-膜复合物的结构,是确定AMPs作用机制的核心。AMPs既可以从其来源中分离获得,例如两栖动物皮肤,也可以在一级序列得到表征后通过化学方法合成。获得大量AMPs后,研究者能够采用更广泛的技术开展结构-功能研究,例如探索单个氨基酸在与膜相互作用中的作用。

AMPs的二级结构可以通过光谱技术测定,而在光谱学确定的构象中,最常见的是α螺旋构象或β折叠构象。天然脂质膜极其复杂且多样,其中包含保护性屏障以及细胞内/细胞外组分。此外,在生理条件下必须维持细菌完整性,以区分AMPs造成的影响与其他无关事件。由于许多生物物理技术会施加较为严苛的条件,需要较长实验时间,分辨率不足以监测AMPs与天然膜之间的相互作用,或者缺乏过滤细胞背景信号的能力,因此关于AMP驱动膜扰动的高分辨率研究主要是在模型系统中完成的。

模型系统使研究者能够设计组成明确的膜体系,并通过生物物理技术开展可靠且可重复的结构和动力学研究。已有多种生物物理技术被用于表征AMPs对膜结构的影响,这些技术列于图4中,包括不同类型的光谱技术,成像技术,量热法,光散射技术以及一系列光学生物传感器。结合计算方法和新兴人工智能方法,这些技术能够提供AMP-膜相互作用不同阶段的信息,并且必须联合使用,才能揭示某种AMP的整体作用机制。

总体而言,由于膜组成的复杂性,以及相互作用过程中AMP和膜都会发生动态变化,AMP-膜相互作用可以说是结构分析中最具挑战性的研究对象之一。下文将进一步讨论这些特征。

2 作用机制:AMP-膜相互作用的连续分子事件

AMP结构的多样性和灵活性会产生极其丰富的相互作用形式,因此很难对这类多肽作用于靶膜的机制进行精确分类。尤其是,过去常根据AMP是否通过不同的孔介导机制发挥作用来定义其机制,但现在已经明确,细胞膜是复杂,拥挤且动态变化的纳米结构。此前针对螺旋型AMPs提出的明确孔结构形成过程,实际上过度简化了AMP与细胞膜相互作用过程中发生的结构变化。

此外,与孔相关的机制主要是针对螺旋型AMPs发展而来的。然而,鉴于只有少部分AMPs具有螺旋结构,对于大多数AMPs的认识反而更加有限。因此,将孔机制视为所有AMPs的主导机制,需要重新评估。归根结底,这种分子细节的缺乏可能限制新型抗菌剂的设计和开发,因为越来越多的证据表明,AMPs的作用机制远比明确的孔形成机制或地毯机制更加复杂。

目前普遍认为,AMPs与膜的主要相互作用可以分为两类机制:膜破坏/膜通透化机制,以及非膜破坏/非膜通透化机制。如图5示意所示,关于作用机制的模型从经典孔形成延伸到多种结构重排过程,例如多肽自组装,双层膜变薄或膜隆起。由于一种特定AMP可能同时涉及不止一种模型,因此有必要理解在膜上可能依次发生并最终导致膜破坏的机制步骤。

2.1 初始吸引与相互作用

AMPs在溶液中通常呈无规结构,其与膜的初始相互作用主要由AMP中的阳离子残基和细菌靶膜中带负电荷的脂质之间的静电吸引驱动。研究显示,赖氨酸和精氨酸能够与脂质双层中的磷酸基团发生强相互作用,这很可能促进许多AMPs最初被吸引到膜表面。在靠近膜的过程中,许多AMPs会从伸展卷曲构象转变为α螺旋结构,如图5所示。

β折叠AMPs在溶液中通常具有更稳定的结构,因为它们常常由二硫键或肽骨架环化所稳定,并且在与膜表面相互作用时可能保持相同的稳定构象,有时还会形成类淀粉样结构(图5a)。

AMPs的一个重要特征是通常具有两亲性,而这种性质对于膜相互作用,多肽组装和裂解活性都十分重要。尽管二级结构在某些AMPs的活性中起关键作用,但也有若干AMPs并不形成任何特定结构,却仍然具有裂解活性。这表明在这些情况下,氨基酸组成和物理化学性质介导了膜破坏过程。此外,在结合-破坏过程中,活性可能更多取决于初始阶段静电相互作用与后续阶段疏水相互作用之间的平衡。

图5｜AMPs与脂质双层相互作用过程中发生的不同结合和组装步骤,这些步骤伴随着结合过程中多肽和脂质分子的结构,取向及组装状态的协同变化。 粉色头基表示带负电荷的磷脂。

2.2 浓度依赖性阈值

AMPs结合到膜上之后,膜相互作用的第二阶段需要达到某种“临界”浓度才能继续进行。随着结合位点处AMP浓度升高,多肽可能发生自缔合,并更深地插入膜核心区域,随后通过多种机制发挥作用(图5d和图5e)。脂质头基组成,膜流动性,以及多肽发生自组装或多聚化的倾向等因素,都会影响这种临界浓度的确定以及后续动力学步骤。

2.3 自缔合与多聚化

当膜结合AMPs达到临界浓度后,一些AMPs会发生自缔合或多聚化,从而实现最终的膜破坏或细胞失活。这一过程可见于桶板模型(图5b),环形孔模型(图5c),聚集模型以及类淀粉样模型(图5a)。AMPs通过多肽-多肽相互作用和多肽-膜相互作用形成复杂结构,而这些结构与特定AMPs的作用机制相关。

多肽能否形成这类超结构,取决于其氨基酸组成以及单体状态下的构象。已有研究显示,一些AMPs能够形成寡聚体,并且这些寡聚体在其活性中发挥作用,例如cathelicidin LL-37,α-defensin-6以及植物来源的kalata B2。所形成复合物的有效性取决于多肽能否将疏水结构域和亲水结构域合理排列,使其朝向膜或复合物中相邻的多肽。

2.4 抗菌作用模型

目前已有多种分子模型用于描述AMPs对膜的作用,如图5所示。这些模型从结构明确的机制,如桶板模型(图5b),环形孔模型(图5c)和去垢剂样地毯模型(图5i),延伸到结构定义较弱的机制,如脂质分隔形成结构域(图5f),界面活性(图5g),非层状相形成(图5h),以及最终的胶束化(图5i)和膜起泡(图5j)。

由于模型种类繁多,多种作用方式可能同时发生,也可能依次交替发生。作用方式还可能受到多种因素影响,包括前文所述的物理化学性质,溶液中多肽浓度,膜结合多肽/脂质比例,多肽和膜的组成与结构,以及所有相互作用组分的结合动力学和结构变化动力学。在各种模型中,桶板/环形孔模型(图5b和图5c)以及地毯样机制已被广泛用于解释AMPs对膜的作用机制,下文将结合图5中的示意图进行讨论。

2.4.1 孔形成

多肽诱导的孔形成主要有两种模型。一种是“桶板”机制(图5b),另一种是“环形虫孔”机制(图5c)。在桶板模型中,AMP首先通过静电吸引结合到膜表面,随后发生构象变化并形成两亲性结构。当多肽浓度达到临界阈值时,单个多肽发生自组装,形成由数量可变的多肽组成的更大结构,并更深地插入膜中,形成类似“桶”的环状孔(图5b)。“板”指的是桶状结构中的各个单独构件。在这种孔结构中,疏水结构域向外朝向膜核心的疏水区域,亲水区域向内朝向含水孔道。这样的排列能够尽量减少亲水残基暴露于脂质疏水尾链,同时也使复合物的疏水区域避免暴露于亲水性含水孔道。

“环形孔”或“虫孔”机制与“桶板”孔形成方式相似(图5c)。这一模型主要来自对magainins和PGLa等α螺旋AMPs的研究。多肽最初被吸引到膜表面,并发生与桶板模型类似的二级结构变化。形成的螺旋最初平行于膜取向,其疏水面与膜结合并置换磷脂头基。这会在疏水区域造成破口,并在膜中诱导正曲率应变。这种应变与膜变薄共同削弱膜完整性,使膜表面对AMPs更加敏感。

当多肽达到临界浓度后,它们发生自缔合,并大致垂直于膜表面取向。此时疏水残基不再暴露于脂质头基,而是形成图5c所示的环形孔复合物。该结构与桶板孔不同,因为多肽仍然与脂质头基相互作用,并未完全位于膜的疏水核心内。这种排列不如桶板孔稳定,因此更加短暂。研究显示,孔的稳定性会受到多肽电荷影响,更多正电荷侧链会产生排斥作用,从而形成半衰期更短的孔。

当孔复合物解体后,一些AMPs被证明可以转位到模型膜的腔侧,这提示该机制也可能是多肽进入细胞并接触潜在胞内靶标的一种方式。

2.4.2 地毯样机制

尽管孔形成机制受到高度关注,许多AMPs实际上通过非特异性膜通透化发挥作用。与前述两种模型类似,多肽最初通过静电作用被吸引到特定靶膜上。结合膜之后,多肽发生构象变化,其疏水区域可能插入膜核心,也可能不插入。达到临界浓度后,这些多肽会以“地毯样”方式有效覆盖膜表面。此过程不再形成进一步的四级结构。一旦达到临界浓度,膜的能量状态和流动性便会发生改变,最终导致膜结构失稳,并无法继续维持。

在地毯机制的最后阶段,当多肽饱和覆盖膜表面时,膜结构会塌陷成胶束,这一过程也被描述为去垢剂样模型。同时,地毯样机制通常也被认为是环形孔形成的前置步骤。研究显示,aurein 1.2,cecropin和indolicidin等AMPs可通过这种方式发挥作用。

图6｜用于研究AMP-膜相互作用的多种模型膜系统,包括溶液体系和固体支持表面体系。 缩写:GUV,巨型单层囊泡;SUV,小型单层囊泡;LUV,大型单层囊泡;MLV,多层囊泡;NP,纳米颗粒;SAM,自组装单层膜;SLB,支持脂质双层膜。

2.5 抗菌肽选择性

如果要利用AMPs的高效力来开发新型治疗药物,就必须保证其具有选择性,即表现出较高的抗菌活性和较低的宿主毒性,并利用原核细胞膜和真核细胞膜之间的根本差异。细菌膜的最外层富含带净负电荷的酸性磷脂,如PG。动物和植物细胞膜则明显不同,主要由PC等中性两性离子磷脂构成,这会降低阳离子AMPs的结合强度。

真核细胞所含的带负电荷脂质通常更多分布在面向细胞质的膜内层,因此不会暴露于细胞外空间。此外,细菌膜中不存在的胆固醇和其他甾醇也可能通过维持膜完整性,使膜更难发生通透化,从而降低AMP活性。这些因素可能对药物开发具有重要价值。

2.6 膜结构与堆积的变化

总体而言,AMPs与膜的相互作用涉及多肽和膜两方面的结构变化与拓扑变化。复杂因素共同决定AMPs破坏膜结构的活性,以及AMPs区分病原体细胞膜和宿主细胞膜的能力。在AMP耐受细菌中,已经发现膜表面电荷,膜堆积或有序性,以及酰基化状态会发生改变。

随着膜结合多肽量的变化,膜堆积或有序性的变化可以与这些膜性质改变相关联。这种关联有助于进一步理解AMP相互作用与膜结构动态变化之间的关系。更重要的是,这类相互作用数据可以辅助开发基于多肽的治疗药物,用于应对耐药微生物感染。

由于膜失稳是AMPs的主要作用之一,除膜表面电荷和膜曲率外,膜脂质的分子组织方式也在AMPs选择性中发挥重要作用。因此,要充分理解AMPs引发膜失稳的机制,就需要阐明控制并维持膜形态,结构和动态稳定性的膜性质如何受到AMP结合的影响。由此可见,表征AMP结合相关的膜变化,对于理解AMPs的作用机制至关重要。

然而,尽管前文描述的不同机制都涉及膜结构变化,但这些机制通常并未明确说明膜结构性质以及膜脂质分子组织方式的具体变化。此外,AMPs导致膜失稳的多种机制作用,主要是在螺旋型多肽中建立起来的,并与前文讨论的物理性质和结构特征相关。这些已经充分表征的结构性质未必适用于非螺旋型AMPs。

最后,考虑到细胞中还存在大量其他膜相互作用分子,并且膜内持续进行着多种生理过程,AMPs对裸膜的影响可能无法完整反映膜扰动的全部机制。尽管如此,要在分子分辨率水平上阐明AMPs的作用机制,仍需要定量表征膜结构在多肽结合和结构变化响应下发生动态改变的倾向。这在一定程度上是因为,目前对于生物膜的结构,分子组织方式和物理化学性质如何影响AMP作用机制的认识仍然有限。尤其是,对这些性质进行定量分析,是表征AMP结合膜过程中的机制步骤的核心。下文将讨论可用于表征这些步骤的不同技术。

3 用于研究AMP-膜相互作用的膜模型

天然生物膜在化学组成和结构性质上都高度复杂。因此,关于单个脂质如何影响膜的物理性质和功能,以及如何影响多肽的结构-活性关系,通常需要借助模型膜系统进行研究。这类模型膜系统可以包含特定脂质的明确混合物,也可以使用从培养细胞中提取的天然脂质。

模型膜系统的制备涉及对合成脂质或天然分离脂质的重构,其浓度,组成,力学性质和几何性质都可以根据特定应用进行良好控制。来自天然细胞的脂质更接近真实膜环境,而纯合成脂质则在理解脂质膜化学结构与动态性质,物理性质和力学性质之间的关系方面具有显著优势,也有助于分析温度,pH,离子强度,水合水平和有机溶剂等环境因素对膜性质的影响。

目前已经开发出多种模型膜系统,既包括溶液体系,也包括构建在不同材料支持物上的体系,尤其适用于光学传感和光谱学应用,如图6示意所示。这些用于模拟生物膜复杂性的模型膜系统,从仅含单一磷脂种类的简单模型,到由多种脂质,蛋白质,碳水化合物以及其他生物分子偶联脂质构建的复杂平台不等。

一般而言,广泛使用的模型膜可按照通用构型分为两类。第一类是悬浮于溶液中的球形囊泡,或包覆在多孔/非多孔球形颗粒上并附着于固体基底的球形膜体系(图6A-D)。第二类是平面脂质双层,既可以自由悬跨在直径从微米到纳米尺度的孔隙上,也可以通过物理吸附或化学吸附固定在平面基底上(图6E-J)。图6示意展示了常用于研究AMP-膜相互作用的一系列模型膜系统,下文将对其作简要介绍。

3.1 溶液中和固体支持物上的脂质囊泡

脂质体(脂质囊泡)是一类用途广泛的模型膜系统,常用于研究侧向脂质组织的相行为,以及多种分子过程,包括细菌毒素/AMPs诱导的膜结构和膜通透性变化。脂质体的制备和表征方法简单且成熟,容易与多种生物物理技术结合,用于研究分子-膜相互作用。

从天然细胞中提取或通过化学方法合成的分子组分,可以通过多种方法进行重构。脂质体大小和层状结构数量的变化,也可以通过挤出和超声处理进行稳定控制。根据制备方法不同,脂质体通常可按双层膜数量分为多层脂质体和单层脂质体,也可按尺寸分为小型单层囊泡(SUV;直径20-100nm),大型单层囊泡(LUV;直径80-400nm),大型多层囊泡(LMV或MLV;直径100-400nm),以及巨型单层囊泡(GUV;约1-100μm)(图6A)。在这一较宽的脂质体尺寸范围中,直径小于100nm的脂质体最适合用于倏逝场传感。

脂质体是亚稳态结构,保存期较短,通常只有数天。然而,脂质体表面可以通过水凝胶,生物聚合物或二糖进行修饰(装饰),以提高其长期储存稳定性。

根据未修饰或化学修饰的金属支持物和介电支持物(基于二氧化硅的支持物)的物理性质,完整脂质囊泡可以通过物理吸附,化学固定或生物偶联整合到基底上。脂质体在未修饰基底上的物理吸附主要由静电相互作用和氢键控制。脂质体以非共价,弱吸附方式结合到基底上的优势在于实验设置简单,既不需要脂质体功能化,也不需要表面修饰;同时,完全可逆的吸附也便于表面再生。

对于未修饰的等离子体基底,如Au和Ag,模型膜系统的结构构型可从囊泡变化为结构化双层膜,具体取决于其晶格结构,形貌和粗糙度。蒸镀Au膜具有疏水性和表面粗糙度,其颗粒状结构直径为15-20nm,粗糙度约为1nm,这些特征可能导致囊泡不易破裂。相比之下,有研究报道,将DOPC:DPPC(1:1)和DOPC:DPPC:胆固醇(1:1:1)脂质体沉积到经过火焰退火并负载于介电支持物上的原子级平整单晶Au(111)表面时,会发生单向融合并形成脂质管状结构。这些管状结构沿着不连续Au台阶的三角形形貌排列,厚度为9nm。

通过将脂质体沉积到几平方微米大小的平整原始模板化Au条带上,可以获得平面脂质双层。这类基底可用于成像研究相分离现象,以及分子在特定膜结构域中的分布。然而,由于表面等离子体共振(SPR)等生物传感系统需要均一的膜层,Au表面通常需要使用多种表面化学方法进行修饰,以便在等离子体基底上均匀稳定脂质体。

除溶液中的囊泡外,脂质囊泡还可以包覆在不同直径的纳米颗粒上,粒径范围为5-200nm,核心组成也可以不同,例如二氧化硅,金,银和量子点(图6B)。脂质双层包覆的纳米颗粒(NP)也可以印刷到固体基底上,形成纳米图案化弯曲模型膜阵列,用于表面敏感技术(图6C)。由于纳米颗粒具有较高的消光系数,由蛋白质和多肽特定结构域介导的脂质体聚集,可以通过结合Förster共振能量转移,动态光散射和光谱技术进行表征。

硅基基底主要用于波导生物传感器,散射分析和成像分析。通过将脂质体沉积到SiO2,SiOxNy或云母上制备支持脂质双层膜(SLBs),涉及囊泡吸附,破裂,融合和铺展等复杂机制。调控SLBs在固体支持物上形成机制的因素,会显著影响脂质双层的结构和物理性质。尽管在某些溶液条件下(例如缺少二价阳离子),一些特定组成的脂质体(例如高胆固醇含量脂质体)无法在基于二氧化硅的基底上形成双层膜,但这些物理吸附的脂质体会形成稳定性较低的不均一层,并在传感器和光散射测量中产生非常不一致的读数。因此,当实验需要保持完整脂质体时,对二氧化硅基底进行化学修饰十分重要,以便保持脂质体完整并满足传感用途。

3.2 脂质双胶束与纳米盘

脂质与去垢剂或短链脂质可以自组装形成纳米级双胶束。双胶束是一类水溶性的二元盘状组装体,其形状,尺寸和组成可以变化,能够在水溶液中提供一种近似平面的圆形膜系统颗粒(图6D)。双胶束为研究多肽/蛋白质-膜相互作用以及药物分配提供了模型膜系统,能够呈现充分水合的平面磷脂双层环境。

双胶束通常通过以下方式制备:先将长链磷脂(14-18个碳)形成干燥膜,再用短链磷脂(6-8个碳)或去垢剂悬液进行水合。脂质在氯仿中溶解并随后蒸发后,通过缓冲液水合形成不同脂质浓度的双胶束。双胶束的大分子性质通常用q比值来表征,即长链脂质与短链脂质(或去垢剂)之间的摩尔比,例如 $q = n_{DMPC} / n_{DHPC}$ 。当 $q < 1$ 时,双胶束被认为是各向同性且快速翻滚的结构,类似胶束,但具有较小的平面双层膜。当 $q > 1$ 时,会形成各向异性双胶束,并表现出更接近细胞样的动态行为。

电子显微镜观察显示,双胶束直径可在10-50nm范围内变化,双层膜厚度约为4-6nm,具体取决于q比值。已有研究描述了多种长链磷脂(DMPC/DPPC/POPC/DMPG)与短链脂质(DHPC/DCPC)在水溶液中形成稳定双胶束悬液的情况。膜蛋白已被证明能够在各向同性和各向异性双胶束中正确折叠,其中后者具有在磁场中取向排列的倾向。

各向同性双胶束和磁场取向双胶束主要被用作模板,用于溶液NMR研究中小型膜插入肽和膜相关肽的结构与拓扑表征,也可结合溶液/固态NMR分析来测定较大膜蛋白的结构。由长链和短链脂质组成的双胶束吸附到聚苯乙烯和SiO2基底上,也为促进支持脂质双层膜(SLBs)形成提供了另一种方法。荧光漂白恢复实验表明,离散盘状双胶束能够融合形成流动性双层膜,该双层膜可系链到醛基功能化聚苯乙烯颗粒上,或形成于未修饰的平面SiO2表面。由双胶束吸附到基底上促进形成SLBs的最佳条件,主要由脂质浓度以及短链脂质与长链脂质之间的比例决定。

盘状脂质双层还可以通过生物素化聚乙二醇(PEG)进行稳定。例如,由磷脂DSPE-PEG2000-biotin组成的PEG稳定纳米双胶束,可通过链霉亲和素固定到生物素化基底上,该基底具有不同程度的羧甲基化修饰以及不同厚度的葡聚糖基质。由此获得的稳定结合双胶束,可作为一种替代性模型膜,用于基于SPR的膜蛋白膜相互作用分析。

3.3.支持脂质双层膜

3.3.1 物理吸附脂质双层膜

在未修饰或经化学修饰的不同材料性质基底上形成平面生物膜,最适合与中子/X射线散射,生物传感和成像系统中常用的平台构型相结合。用于构建波导集成生物传感器的基底,如氮氧化硅,氧化硅,氮化硅,以及少量聚合物,允许膜直接吸附;而金属等离子体传感基底则通常需要通过介电材料或有机分子单层进行修饰,以促进膜吸附。

平面支持脂质双层膜(SLBs)可根据基底表面性质以及膜-基底相互作用类型广泛分为若干类别,如图6所示。第一类固体支持膜中,脂质双层可以构建在孔口上,形成自由悬立脂质双层膜(图6E);也可以通过非共价方式吸附(物理吸附)到未修饰基底的亲水表面上,例如玻璃,云母或二氧化硅(图6F),还可以吸附到以-COOH和-OH为末端基团的自组装单层膜(SAMs)修饰基底上(图6G)。脂质单层也可以吸附到疏水性SAM上,该SAM由短链或长链烷基链共价连接在基底表面,从而形成杂化脂质双层膜(HLBs)(图6H)。第三类膜系统是在化学修饰的亲水表面上形成共价固定/锚定的脂质单层或双层(图6I)。

在亲水支持物上形成单一双层膜,可以通过将脂质囊泡分散液与基底孵育实现,也可以在基底材料存在下通过脂质去垢剂溶液透析实现。为了在固体支持物上获得无缺陷双层膜,即使只使用单一脂质种类,也需要针对特定脂质组成系统测试并优化多个实验参数。这些参数通常与基底表面性质,脂质体性质以及整体溶液性质和条件有关。

已知通过囊泡融合可以在高度亲水的云母,二氧化硅固体表面,以及氧化聚二甲基硅氧烷(PDMS)上形成完全流动的支持双层膜。其中二氧化硅固体表面包括玻璃,石英,热生长二氧化硅和溅射二氧化硅,而氧化PDMS表面呈现亲水性SiOx特征。然而,当脂质体数量低于临界表面覆盖度时,囊泡会以完整形式吸附在SiO2表面。相比之下,脂质囊泡暴露于其他亲水固体表面时,可能不会形成完全流动的双层膜,而是在氧化金,氧化铂或二氧化钛表面形成其他脂质结构。

二价阳离子也被发现能够促进混合PC/PG囊泡附着,形成支持囊泡层,并促进纯PC囊泡形成双层膜。加入高浓度钙离子可以促进脂质从脂质体转移到普通亲水支持物上,并简化吸附模式。其他“内在”促融合因子,如蛋白质以及较高DPPE/胆固醇比例,也常被用于促进脂质转移以及在固体表面形成双层膜。

图7｜制备聚合物支持脂质单层膜/双层膜的多种方法示意图。

3.3.2 聚合物缓冲平面双层膜

脂质双层膜直接吸附到基底上可以形成非常稳定的膜系统。厚度仅为1-2.5nm的超薄水层可在模型膜与固体支持物之间起到润滑作用,并保留天然膜中存在的脂质长程侧向流动性和热力学性质。然而,脂质头基与基底表面距离过近也会带来一些缺点。磷脂头基与亲水基底之间的相互作用会减缓侧向扩散,并削弱膜的二维流体性质。膜-基底相互作用还可能导致内外叶之间出现不对称的侧向流动性。此外,狭小的膜-基底间隙也限制了跨膜蛋白的整合,并且由于构象效应以及与基底的强相互作用,会降低已整合蛋白的活性和流动性。

尽管吸附双层膜和杂化双层膜系统已经广泛用于结构表征相关的光谱学应用,但上述缺陷限制了这类系统在若干光学和电化学生物传感应用中的使用。通过在膜双层和固体基底之间引入柔软的亲水聚合物网络或聚电解质膜(10-100nm),可以增加水性润滑层厚度,从而同时维持膜的动态性质以及功能性蛋白-膜组装体的结构完整性(图6J)。这种聚合物膜作为固体基底与脂质双层膜之间的间隔层,可以最大限度减少基底带来的不利影响,例如缺陷形成,侧向流动性降低,以及膜自修复能力受限。

此外,聚合物界面允许跨膜蛋白以天然形式整合进入膜中,其表面结构域可伸入亲水聚合物网络。嵌入聚合物支持双层膜中的脂肽表现出显著的长程侧向流动性,这也证明了脂质和整合分子的动态性质。聚合物能够在宏观尺寸基底(cm2)上自修复膜中的局部缺陷,最终形成无缺陷脂质双层膜,并提高跨膜电阻,从而有利于离子通道表征。

为了在弹性模量可调的柔软聚合物支持物上组装脂质膜,已经发展出多种方法,如图7示意所示,用于构建无缺陷的脂质双层膜-聚合物复合系统。第一种方法是将高度水溶性的天然聚合物膜化学接枝到固体表面,例如葡聚糖,透明质酸,纤维素和聚丙烯酰胺,随后通过脂质体吸附沉积脂质双层膜,并由吸引性静电相互作用加以稳定。第二种方法是在固体支持双层膜中加入聚乙烯亚胺(PEI)聚合物,使其置换预先沉积的脂质,从而形成聚合物支持双层膜;在这一过程中,聚合物-基底之间的吸引相互作用似乎强于聚合物-双层膜之间的相互作用。第三种方法是沉积由带烷基侧链的棒状分子构成的柔软亲水或疏水多层膜,随后通过Langmuir-Blodgett(LB)转移形成脂质单层膜或双层膜。第四种方法是将脂质头基经聚合物修饰的脂质聚合物共价连接到基底表面,随后进行囊泡融合。

图8｜生物细胞中NMR信号的典型来源包括膜脂质和膜蛋白、核酸以及细胞壁。

底层聚合物可将系链双层膜与固体表面分隔开来,而偶联到基底上的聚合物层厚度和密度可以通过旋涂或逐层沉积进行控制。整个膜系统可以通过多种叠加的分子相互作用保持稳定,这些相互作用主要来源于静电作用,范德华作用和疏水作用。整个系统的稳定性取决于聚合物-基底界面和聚合物-双层膜界面处的吸引势,以及二者相对强度之间的平衡。

稳定聚合物支持脂质双层膜的另一种方法,是基于聚合物缓冲层与固体基底之间,以及脂质双层膜与聚合物缓冲层之间的受控共价系链。通过改变基底上交联分子的密度,可由不同自组装条件调节系链密度;而通过不同反应时间,则可以调节实际系链位点的密度。目前有多种技术可用于将聚合物共价系链到固体表面。共价系链可以通过在Si/SiO2或氧化铟锡表面形成烷基硅烷单层膜来介导,也可以通过在Au和GaAs表面形成烷基硫醇或烷基硫醇盐单层膜来实现。

单层膜酰基链末端可以通过不同官能团进行共价修饰,包括:(1)环氧基团,可与羧基共价结合;(2)胺基,可与链上的羧基共价结合,其中羧基通过琥珀酰亚胺酯或咪唑酯偶联进行活化;(3)光交联基团,例如二苯甲酮硅烷功能化玻璃,可通过光化学方式与任意聚合物片段连接。接枝单层膜中活性锚定位点的密度随后可以通过水解对环氧基和光交联剂进行受控部分失活来调节。由于这一过程会产生极性基团,固体表面也会同时变得高度亲水,从而显著减少生物大分子的非特异性结合。

通过电化学聚合沉积极薄聚合物膜,也是形成柔软功能化聚合物膜,或膜用聚合物缓冲层的另一种方法。合成聚合物链(例如PEG)或寡肽(例如抗原表位)可与苯酚衍生物偶联,而这些苯酚衍生物能够在阳极电极表面发生聚合。

3.3.3 脂质体与表面的直接偶联

脂质体也可以直接偶联到经过多种功能基团修饰的基底上。共价偶联能够使脂质体稳定且牢固地附着在传感基底上。多种偶联试剂可用于将具有不同功能化特征的脂质体选择性固定到传感基底上,也可用于构建离散的脂质体阵列图案。此外,脂质体还可以通过各种同双功能或异双功能交联剂偶联到功能化基底上。

脂质体也可以在修饰有系链基团的基底上保持稳定,这些系链基团可插入脂质体双层膜中,同时不导致脂质体破裂。系链方法通常包括将含有疏水酰基链的聚合物共价连接到基底上,具体方式可以是在空气/水界面将预先组织好的脂质共聚物转移到预活化基底上,也可以将预活化基底浸入脂质共聚物溶液中。另一种方法是先通过逐层沉积形成同聚物或异聚物层,随后将酰基链共价连接到该聚合物层上。酰基链可以在溶液中固定,也可以通过将空气/水界面上预先组织的、含有反应性锚定基团的脂质单层膜转移到基底上的聚合物层来实现固定。烷基链修饰生物聚合物膜还可以通过将可溶性脂质共聚物水溶液直接蒸发到基底上制备。

除转移方法外,还可以通过“接枝到”或“从表面接枝”策略,利用亲水聚合物作为分子间隔物对基底进行钝化。在“接枝到”方法中,带有转化末端基团的聚合物与基底表面的功能基团反应,在沉积脂质双层膜之前形成接枝聚合物链,从而允许对脂质双层膜进行直接图案化。“从表面接枝”技术通常用于形成大面积聚合物层,其中先用引发剂修饰表面,再固定锚定基团。随后,可通过多种原位表面引发聚合(SIP)反应,从锚定基团上生长出薄层或厚层的刷状聚合物间隔层,这些反应包括自由基链式聚合,活性阳离子聚合,以及原子转移自由基聚合等受控活性聚合。单体可聚合形成线性结构或支化结构。

这种“从表面接枝”方法能够产生高密度聚合物刷,但这类聚合物刷难以进一步功能化,也不适合用于构建低功能基团密度的传感器图案。生物功能化脂质体通常通过将合成脂质与生物亲和基团混合制备,例如将生物素化PE或NTA修饰脂质与其他脂质组分按特定摩尔比混合,并采用各种标准脂质体制备方法形成脂质体。由于操作简单,这种方法已经得到广泛应用。

图9｜A)脂质膜中短杆菌肽A自组装模型,显示单体之间可能存在的 $^{13} C$ 和/或 $^{15} N$ 原子间距离;B) $^{13} C -^{15} N$ REDOR NMR退相曲线,用于确定标记位点之间的距离。

3.4 天然来源的模型膜系统

天然膜可以被分离出来并用于生成脂质体。这一过程可以通过机械破碎(匀浆)细胞或组织,随后进行密度梯度差速离心以分离质膜或细胞器来实现;也可以通过有机溶剂和去垢剂提取脂质,随后将提取出的脂质重构为膜。分离得到或重构得到的膜随后可以通过物理吸附或化学吸附方法,在靠近固体基底表面的位置保持稳定。

然而,这些方法存在一些根本性缺陷,包括来自不同细胞器的膜组分污染,双层膜不对称性和侧向结构域组织丧失,有机溶剂和去垢剂残留对膜性质造成不利影响,以及膜蛋白发生构象和功能改变。为了应用表面敏感技术表征膜性质及其相关生化过程,天然膜可以按照取向选择性方式偶联到平面基底上。

已有研究通过将人红细胞影细胞膜和肌质网囊泡铺展到玻璃表面5-10nm厚的水合纤维素缓冲层上,在固体支持物上制备天然膜片段,从而形成无缺陷的聚合物支持天然膜,并使胞质结构域暴露于整体溶液中。

从细菌细胞中分离天然膜囊泡,也可用于构建具有类似天然细菌膜分子组分的SLBs。外膜囊泡(OMV)是直径20-250nm的球形囊泡,在革兰氏阴性菌生长过程中,由于膜泡从细菌外膜表面脱落而自然分泌。类似于在玻璃基底上通过巨型多层囊泡(GMVs)和PEG-脂质体的连续吸附形成SLBs,天然细菌外膜(OM)支持双层膜也可以通过分步吸附OMV,随后加入PEG-脂质体以诱导囊泡-双层膜在玻璃基底上形成来实现。

所得SLBs通过一种“降落伞机制”使其胞外叶暴露于整体水相中。随后,这种天然细菌OMSLB被进一步用于表征阳离子多肽PolymyxinB的抗菌机制,包括膜破坏动力学以及膜力学性质变化。将从不同生长条件和不同细菌菌株中分离的细菌OMVs整合到纳米孔阵列中,可能提供一种具有广泛应用价值的系统,例如用于探测药物对不同物理化学性质细菌膜的响应。

图10｜利用 $^{2} H$ NMR和位点特异性标记的PGLa研究AMPs在脂质膜中的位置、取向和组装。 AMP PGLa在多个位置用氘代Ala进行标记,并在取向双层膜中测量 $^{2} H$ -NMR谱。可从所示的各个谱图中确定裂分,并通过分析这些裂分来确定多肽在脂质膜中的位置、取向和组装。

4 研究 AMP 介导的生物膜破坏的实验方法

4.1 用于AMP表征的光谱技术

利用光谱技术研究抗菌肽(AMPs),尤其是核磁共振(NMR),圆二色谱(CD),傅里叶变换红外光谱(FTIR)和紫外-可见光谱(UV-vis),对于表征AMP在不同生物化学环境中的复杂相互作用非常重要.这些技术能够从低分辨率到高分辨率层面揭示AMP与分子靶标,例如脂质膜相互作用时发生的结构与动力学变化.这一部分概述这些技术在实验中的应用,重点讨论如何在溶液中,模型膜复合物中或微生物环境中确定AMP的结构修饰,构象柔性和相互作用.同时也讨论这些方法的局限性,以及进一步表征复杂分子组装体的潜在发展方向.结合其他生物物理和生物化学研究,这些光谱技术已经帮助阐明AMP的作用机制.随着技术进步,它们还揭示了新的潜在抗菌活性途径.

4.1.1 核磁共振(NMR)光谱

NMR是一种在AMP研究中发挥关键作用的光谱技术.许多AMP在类脂质膜环境中的高分辨率结构都是通过溶液态NMR确定的.NMR利用核自旋的磁性,能够在较少受分子环境限制的情况下提供结构和功能信息.不过到目前为止,在原位环境中,例如活细菌中,AMP-AMP和AMP-脂质组装体的高分辨率结构仍然很少被解析.下面几部分将介绍用于确定AMP结构和脂质膜结构的NMR技术,并进一步讨论在完整细胞中开展这些实验面临的挑战.

4.1.1.1 AMP研究中的NMR原理和重要实验考虑

NMR光谱基于核自旋与强磁场之间的相互作用.核自旋记为 $I$ ,是原子的内禀物理性质,其数值取决于同位素,可从0(NMR不可见)到8不等,也可以为半整数.在AMP研究中, $^{1} H (I = 1 / 2)$ , $^{2} H (I = 1)$ , $^{13} C (I = 1 / 2)$ , $^{15} N (I = 1 / 2)$ 和 $^{19} F (I = 1 / 2)$ 常用于NMR实验设计(图8).具有NMR活性的同位素可通过生物化学方式引入,以获得特异性信息,并避免背景信号干扰.同位素的天然丰度是一个重要参数.例如, $^{1} H$ 是一种丰度很高的同位素(>99%),但多数其他同位素,如 $^{13} C$ (1.1%)或 $^{15} N$ (0.4%),丰度较低,因此在AMP生产过程中可能需要特异性富集,方式包括化学合成或生物化学表达系统.这是因为NMR技术本身灵敏度较低,信号强度与磁场中自旋数量相关.不过这一特点也可以转化为优势,例如用于降低不需要的背景信号,实现精确定量,或开展位点特异性研究.

NMR也是研究AMP对其靶标影响的有力工具.例如,生物膜由磷脂,甾醇和其他分子组成,可通过 $^{31} P (I = 1 / 2, 天然丰度 100$ , $^{13} C$ , $^{2} H$ (天然丰度0.02%)或 $^{19} F$ NMR实验进行研究.核自旋与磁场之间最简单的相互作用发生在 $I = 1 / 2$ 的自旋中.这类相互作用主要由化学位移,偶极耦合和 $J$ 耦合主导.而更高自旋值( $I \geq 1$ )的体系则主要受更强且更复杂的四极相互作用支配.

化学位移由原子核周围的电子环境引起,并取决于电子分布在磁场中的取向.电子分布,即化学位移张量,会受到原子之间共价相互作用或静电相互作用的强烈影响.吸电子基团会使原子核去屏蔽,表现为ppm或Hz数值增加,即低场位移.供电子基团则相反.因此,可以根据化学位移识别某个原子的化学环境.例如,羰基 $^{13} C$ 通常在约170 ppm处共振,而甲基 $C H_{3}$ 碳通常在约15 ppm处出现信号.化学位移分散对于利用 $^{1} H$ NMR确定AMP结构非常有用.例如,胺基NH的 $^{1} H$ 信号会根据AMP二级结构不同,在约8.5 ppm至6 ppm之间变化.值得注意的是,磁场强度越高,化学位移分散越大,分辨率也越高.

NMR信号的位移,即化学位移扰动,可由残基之间新的相互作用引起,例如主链 $N - H \dots O = C$ 氢键,或侧链静电/疏水相互作用.这些变化可提示环境发生改变,例如从水相转移到脂质膜表面或膜内部.化学位移指数(CSI)通常通过测量NMR信号相对于无规卷曲结构平均值的扰动来计算,从而判断其趋向于 $α$ 螺旋还是 $β$ 折叠构象.

化学位移相互作用的另一项重要应用是监测取向体系中螺旋结构的 $^{15} N$ 信号.由于化学位移取决于张量在磁场中的取向, $^{15} N$ 信号可用于确定AMP插入平行或垂直于磁场取向的脂质双层时的倾斜角.对于其他自旋,如 $^{13} C$ ,以及其他二级结构,如 $β$ 折叠,这一方法并不简单,尽管已有相关研究报道.一般而言,化学位移张量在磁场中的取向并非各向同性.对于在NMR时间尺度上静止的自旋体系,会观察到各向异性信号,称为化学位移各向异性(CSA).CSA会妨碍高分辨率NMR测量,因为它会产生宽而重叠的信号.但CSA也能提供关于分子取向,有序性或堆积方式,以及AMP-膜相互作用所致扰动的特异性信息.例如,磷脂的 $^{31} P$ CSA可区分AMP存在下诱导形成的不同膜相,从脂质双层到胶束组装体均可辨别.

偶极耦合产生于两个自旋感知彼此磁场时.通过化学键传递的相互作用称为 $J$ 耦合,表现为NMR峰裂分,范围可从约1 Hz到数百Hz.空间偶极耦合则依赖距离,与 $1 / r^{3}$ 成正比,也依赖角度,因此能够提供丰富的结构和动力学信息.偶极耦合强度受自旋旋磁比调控.在1 Å距离处, $^{1} H -^{1} H$ 耦合强度可高达约120 kHz,而 $^{13} C -^{13} C$ 耦合约为7.6 kHz.当距离增加到5 Å时,二者分别降低到约960 Hz和61 Hz.通常,低至数Hz的耦合也可以测量,对应距离可达约15 Å,具体取决于所涉及的自旋类型.测量残基内和残基间原子偶极耦合的NMR实验能够解析分辨率为1-2 Å的AMP高分辨率结构.值得关注的是,脂质与AMP残基之间的距离也可被测量,例如利用 $^{31} P -^{13} C$ 或 $^{31} P -^{19} F$ 偶极耦合.不过,由于长程距离对应的偶极强度较弱,利用NMR技术获取长程距离更具挑战性.虽然顺磁自旋的使用已被成功探索,NMR仍然是一种强大的高分辨率技术,尤其适合研究15-20 Å范围内的相互作用.

AMP相关NMR结构研究存在若干困难.首先,在大多数AMP-AMP和AMP-脂质组装体中,相互作用具有动态性和/或异质性,因此测量到的偶极耦合往往是距离集合的平均值.要从中提取距离集合,需要使用复杂模拟,将实验结果拟合到理论值.用于分析这类实验的大多数程序代码并不容易获得,实际上通常由少数实验室自行开发.其次,如果仅使用天然序列来确定肽组装体的高分辨率结构,而不引入可能造成伪影的化学修饰,例如 $^{19} F$ 原子或顺磁基团,则必须精确设计标记方案.通常, $^{13} C$ 和/或 $^{15} N$ 标记原子需要位于最多6-8 Å范围内,才能产生可检测的偶极耦合,这限制了可用原子的数量(图9).这也是一项成本较高的工作,因为选择性同位素富集并不简单.例如,用于化学肽合成的缬氨酸,若仅在主链羰基位置进行 $^{13} C$ 标记,与完全 $^{13} C$ 标记相比,成本差异可能超过20倍.随着标记氨基酸数量增加,谱峰拥挤会妨碍对耦合自旋体系的分析,进一步凸显昂贵标记方案需要谨慎设计.

对于 $I > 1 / 2$ 的自旋,如 $^{2} H (I = 1)$ ,四极相互作用主导NMR信号,会产生四极裂分,表现为NMR信号的对称图像.在AMP研究中,含 $^{2} H$ 标记酰基链的脂质被广泛用于监测肽相互作用后疏水内部区域的变化. $^{2} H$ 原子在磁场中的重新取向会平均化四极相互作用强度.因此,AMP孵育后四极裂分减小,说明在NMR时间尺度上( $^{2} H$ 约为微秒至毫秒)运动增强或无序度增加,并且这一变化可沿酰基链定位.另一类 $^{2} H$ NMR应用需要在AMP的特定氨基酸位点进行标记,以探测快速运动,例如侧链旋转,肽主链柔性,全氘代酰基化AMP中的酰基运动,以及肽-脂质相互作用.这些信息对于理解AMP如何与细胞靶标相互作用至关重要(图10).虽然这类实验并不常见,但已有若干NMR研究使用氘代残基评估肽在取向脂质双层中的取向和动力学.

除了组装体集合本身外,分子运动对NMR相互作用平均化的影响也是设计AMP研究实验方案时的重要因素.在磁场中快速重新取向的分子会将NMR相互作用平均到各向同性值.这会产生尖锐,强烈且更简单的NMR信号,从而提供AMP的高分辨率结构和动力学信息.但代价是取向信息减少,尤其是相对于其在脂质膜中位置的信息会受到限制.例如,许多AMP结构都是通过溶液态NMR在胶束环境中高分辨率确定的.然而,对于脂质体或细胞等较大结构,较慢的重新取向速率(翻滚)会产生更复杂且更宽的NMR信号,通常需要利用固态NMR实验进行研究.例如,AMP对细胞膜分子堆积或有序性的影响已通过 $^{31} P$ 固态NMR得到广泛研究,从而获得关于孔形成类型或对某类脂质具有特异性亲和力的信息.溶液态和固态NMR这两个方向都需要专用硬件,例如专门的NMR探头,也对样品制备提出了特定要求.

最后,由于NMR固有灵敏度较低,特别是在固态NMR实验中测量相对缓慢翻滚分子的宽信号时,相关技术和硬件一直在密集发展.其中,动态核极化(DNP)最近为复杂膜环境中的AMP研究开辟了新的可能性.DNP利用来自自由基的电子源对 $^{1} H$ 质子进行超极化,可将NMR信号增强数个数量级,从而可以研究材料量很少的样品,例如AMP的细胞内NMR研究,或利用天然丰度下高度稀释的自旋,例如 $^{15} N$ .不过,自由基激发需要持续高功率微波照射,因此目前DNP NMR通常在低温条件下进行(约100 K),这要求对生物样品进行冷冻保护.低温会显著增加NMR信号线宽,导致严重的信号分辨率损失.但经过冷冻保护的活细胞冻存样品,例如大肠杆菌细胞,寿命大幅延长,使更复杂的NMR实验成为可能.这些实验可通过多维脉冲序列部分恢复分辨率.

图11｜(左图)在DPC胶束中对LL-37进行溶液态NMR研究,显示单体-单体接触;(右图)寡聚体结构模型。

4.1.1.2 AMP二级结构的确定

AMP二级结构主要可分为四类:线性 $α$ 螺旋,线性 $β$ 折叠肽,富含半胱氨酸的环肽,以及无结构肽.NMR是确定肽二级结构的强大技术.AMP一级序列主要由20种天然氨基酸组成,尽管许多AMP含有D-氨基酸.一些非天然修饰也已被用于提高细胞稳定性和/或增强抗菌活性.这些天然氨基酸的 $^{1} H$ , $^{13} C$ 和 $^{15} N$ 化学位移已经得到充分表征并制成表格,因此可以较快且较准确地归属NMR信号,并利用CSI判断二级结构倾向.例如,通过化学键传递的 $^{1} H -^{1} H$ 同核相关实验(TOCSY,COSY脉冲序列),以及 $^{1} H -^{13} C$ , $^{1} H -^{15} N$ 异核相关实验(HSQC,HMBC),常用于将主链和侧链 $^{1} H$ 信号归属到具体残基.而空间 $^{1} H -^{1} H$ 相关实验(NOESY)则提供用于计算结构的距离约束.

对于长度约30-40个氨基酸以内的AMP序列,这些二维(2D)实验通常无需 $^{13} C$ 和/或 $^{15} N$ 同位素富集即可进行.更长序列则可能需要采用标记方案,包括全标记或氨基酸特异性标记.原因在于NMR信号天然容易重叠,而更高维实验可帮助分离这些信号.值得指出的是,NMR实验库非常丰富,可用于操控自旋之间的磁化转移,从而精确控制所记录的NMR信号,用于归属和距离约束测量.例如,3D $^{15} N -^{1} H -^{1} H$ 或 $^{15} N -^{13} C -^{1} H$ NMR脉冲序列可以缓解信号拥挤,但在天然丰度下通常需要数天实验时间才能获得所需信噪比(S/N),因此 $^{13} C$ 和/或 $^{15} N$ 标记往往是前提.对于溶液态NMR结构研究,低温探头可显著增强NMR信号,这对于观察弱偶极耦合是必要的.此外,较长的AMP序列(>40个氨基酸)由于谱峰重叠更严重,结构研究更加困难.由于分辨率与磁场强度成正比,高场NMR谱仪(>600 MHz)可能是成功确定较长AMP结构的关键.

对于具有线性氨基酸序列的膜活性AMP,胶束和小型脂质组装体,如各向同性双胶束或纳米盘,对于确定其活性构象中的二级/三级结构非常重要(图11).事实上,大多数线性AMP在水环境中呈无规卷曲或无结构构象,但在与脂质膜体系相互作用时会转变为螺旋构象,较少情况下转变为 $β$ 折叠构象.环肽或含二硫键的肽会形成稳定且高度受限的结构,这些结构大多不依赖环境.因此,大多数相关研究在水环境中进行.一些有机溶剂也可用于提高氢键形成倾向,例如三氟乙醇(TFE).TFE通过让AMP暴露在较低介电环境中发挥作用,TFE的介电常数约为27,而水为78.表2列出了若干AMP类别在不同环境中的NMR结构.

在膜模拟体系中,典型脂质/肽(L/P)摩尔比约为100:1,这会产生强烈的 $^{1} H$ 背景信号,通常需要使用氘代脂质进行抑制.全氘代十二烷基磷酸胆碱(d38-DPC)或十二烷基硫酸钠(d25-SDS)胶束已被广泛用于溶液NMR结构研究.胶束直径约5 Å,翻滚速度快,因此往往能提供尖锐的NMR信号,便于采集高分辨率数据.小双胶束(各向同性双胶束)和纳米盘半径约10 Å,能够提供更接近膜的环境,其曲率更低并具有天然双层结构.这些因素可能对AMP二级结构和分子组装产生重要影响.不过,这些体系的NMR信号更宽,背景信号也更显著,因为它们不太适合完全氘代,因此AMP可能需要进行同位素标记.

溶液态NMR仍适用于这些快速重新取向的对象.而与脂质体或更大双胶束(各向异性双胶束)相互作用的AMP则需要通过固态NMR技术和硬件进行研究.大型脂质体系直径可达数百至数千纳米,其缓慢重新取向会导致NMR信号明显展宽,这限制了固态NMR在AMP结构常规测定中的应用.对于这类研究,需要进行同位素富集以支持多维实验,并需要对样品进行快速魔角(54.7°)旋转(MAS).MAS可通过平均各向异性相互作用,如CSA和偶极耦合,重新引入高谱分辨率.先进的MAS探头可达到>150 kHz的旋转速度,从而完全平均最强的 $^{1} H -^{1} H$ 偶极耦合(约100 kHz).由于脂质体几乎可以由任意脂质组成制备,这些体系使研究特定脂质在AMP组装中的作用成为可能,也可用于研究AMP对脂质膜结构和动力学的影响,例如脂质双层堆积扰动.不过,由于谱峰拥挤,解析出的三维结构数量仍然较少.

AMP抗菌活性的分子机制需要肽在主要呈平面的双层膜界面积累.因此,为了在最接近天然条件下研究肽自组装或积累于脂质膜内和/或破坏膜完整性的分子机制,需要使用大型分子体系.这些NMR实验必须在大型脂质体和较高肽/脂质摩尔比条件下进行,因此需要固态NMR.溶液NMR通常用于生成初始结构,随后再在更复杂环境中进行精修.值得注意的是,一些AMP,尤其是基于具有聚集倾向肽段设计的计算序列,例如纤维状淀粉样肽,即使没有脂质膜也可以发生寡聚化.这类自组装机制适合通过聚集体的固态NMR进行监测.例如,Ac-I3XGK-NH2( $X = Q, S, N$ )自组装形成纳米带的过程,曾利用 $^{13} C^{15} N$ REDOR NMR实验研究,其标记方案为 $[^{15} N] I l e 1 [1 -^{13} C] I l e 3 - A c - I 3 Q G K - N H 2$ .接近的 $^{15} N$ 和 $^{13} C$ 标记原子会产生去相位 $^{13} C$ 谱,该谱可用SIMPSON程序拟合,结果显示肽-肽组装体形成反平行三聚体(图12).这一组装模型还得到X射线衍射(XRD)研究确定的相邻 $β$ 折叠链间距支持.

表2｜不同环境下AMP的NMR结构示例

4.1.2 圆二色性(CD)光谱

圆二色性光谱是一种广泛用于研究AMP二级结构的技术,与NMR相比,其实验流程通常更加快速且灵活。CD利用分子对偏振近紫外/远紫外波长的吸收,提供溶液中AMP整体二级结构含量的信息,例如 $α$ -螺旋、 $β$ -折叠或无规卷曲。

4.1.2.1 AMP研究中的CD原理与实验注意事项

手性中心中具有光学活性的分子轨道,倾向于在约 $320$ 至 $160 n m$ 范围内对右旋和左旋圆偏振光产生不同吸收。这种吸收差异会产生椭圆偏振光波,并以波长 $(λ)$ 为函数进行绘制。所得光谱线形的最大值对应于旋光色散(ORD)中旋转角为零的波长。出射光的椭圆率,单位为 $d e g . c m^{2} . d m o l^{- 1}$ ,定义为椭圆短轴与长轴之比。值得注意的是,CD对手性中心的对映异构性质非常敏感,即L型和D型氨基酸具有相似的吸收带,但符号相反。

对于AMP而言,发色团是肽键,手性中心是 $α$ -碳,其空间排列以及与邻近原子的相互作用会诱导出依赖于二级结构的光谱线形。尤其是,螺旋或 $β$ -折叠构象中的氢键网络,以及无规卷曲结构中氢键网络的缺乏,会产生激发分子轨道的特定电子跃迁。具体而言,氧原子上的孤对电子( $n$ 轨道)与 $π^{*}$ 反键轨道之间的配对跃迁( $n \Leftarrow π^{*}$ 跃迁)会在 $220 n m$ 处显示吸收带,而 $190 n m$ 处的吸收带来自非键合 $π$ 轨道到 $π^{*}$ 轨道的跃迁( $π \Leftarrow π^{*}$ 跃迁)。这两种跃迁对AMP的手性环境非常敏感,能够从整体上反映多肽中的二级结构含量。

图12｜(A)来自 $^{13} C {^{15} N}$ REDOR NMR的 $[^{15} N] I l e 1 [1 -^{13} C]$ Ile3−Ac-I3QGK-NH $_{2}$ 肽的退相曲线,并给出使用 $^{13} C -^{15} N$ 距离分别为8.8、7.4和8.1 Å的模拟曲线及肽-肽自组装模型;(B)该模型用于生成通过极性拉链(polar zippers)和疏水黏附交错稳定的纳米带组装,其中β-折叠参与结构稳定。

例如,无序多肽的远紫外( $160 - 240 n m$ )CD光谱通常以 $200 n m$ 以下的单一负峰为特征; $α$ -螺旋结构在约 $208$ 和 $222 n m$ 处显示两个负峰,并在约 $190 n m$ 处显示一个正峰; $β$ -折叠结构通常在 $217 n m$ 处显示一个负峰,并在约 $195 n m$ 处显示一个正峰。有趣的是,在 $α$ -螺旋结构中, $208$ 和 $190 n m$ 处的电子跃迁分别沿平行于和垂直于螺旋轴的方向偏振,因此可使用取向圆二色性(OCD)在取向体系中测量螺旋倾斜角。对于处于表面结合S态、平躺在膜表面的 $α$ -螺旋型AMP,当入射光束平行于膜法线时,由于电场与平行偏振跃迁发生强相互作用,CD光谱会在约 $208 n m$ 处显示强负峰(图13)。对于倾斜的T态, $208 n m$ 吸收带的强度会显著降低;而对于插入的I态,由于螺旋以及跃迁偶极与电场方向垂直排列, $208 n m$ 附近的吸收带会消失。

近紫外( $240 - 320 n m$ )反映芳香族氨基酸侧链的环境,主要是色氨酸,因为其比苯丙氨酸或酪氨酸更加敏感,因此可提供蛋白质三级结构的信息。其吸收机制依赖于彼此垂直的 $^{1} L_{a}$ 和 $^{1} L_{b}$ 偶极跃迁的重叠。 $^{1} L_{a}$ 跃迁偶极沿着连接吲哚基团中心与环上氮原子的方向。Trp的近紫外CD光谱较为复杂,因为可能发生四种类型(I至IV)的跃迁,从而调节 $^{1} L_{a}$ 和 $^{1} L_{b}$ 吸收带的强度与符号。不过,已有研究尝试在Trp极性基团(NH-)局部环境变化时区分 $^{1} L_{a}$ 和 $^{1} L_{b}$ 吸收带的贡献,从而揭示Trp残基构象异构体/旋转异构体的异质性,这种异质性取决于聚集状态和/或其在脂质膜中的位置。

CD测量需要稳定的光源和低噪声检测器。最新的台式CD光谱仪通常使用氙灯或氘灯,能够提供强度足够的波长,最低可达约 $180 n m$ 。为了获得更低波长,同步辐射光束硬件已被成功应用,可提供更高的信号灵敏度,但代价可能是样品完整性受损,例如发生漂白,同时仪器可及性较低。吸收光谱依赖比尔定律,因此样品浓度对于获得良好数据至关重要,通常可通过使用合适的多肽浓度和/或选择适当的比色皿光程进行控制。

在AMP远紫外CD研究中,当体系中存在胶束或大单层囊泡(LUVs)时,通常使用 $1 m m$ 光程的比色皿,但LUV尺寸必须尽可能小,约 $\leq 100 n m$ ,因此常使用小单层囊泡(SUVs)。水在 $185 n m$ 以下会产生强吸收,许多缓冲液和盐也会在 $200 n m$ 以下强烈吸收。水或磷酸盐缓冲液的背景信号最弱,而NaCl会增加吸光度,并可能导致散射,从而降低信噪比(S/N),因此其浓度必须尽可能降低或避免使用;但在较短光程的比色皿中,例如 $0.1 m m$ 甚至 $0.05 m m$ ,仍可使用NaCl。背景信号、吸收和散射问题限制了AMP可被研究的生化环境。例如,在细菌存在下研究AMP会受到强烈光谱背景的影响。对于近紫外CD三级结构研究( $250 - 350 n m$ ),由于相关跃迁信号强度较低,并且发色团,主要是Trp侧链,浓度较低,因此需要更长光程,通常为 $1 c m$ ,以及更高的样品浓度。

图13|取向脂质双层膜中多肽取向对CD光谱行为的影响。

4.1.2.2 远紫外CD研究:二级结构

远紫外CD通常在台式仪器上于 $180 - 260 n m$ 波长范围内测量,但使用同步辐射光源时,测量范围可向下扩展至 $160 n m$ 。当AMPs与模型膜或其他分子靶标相互作用时,CD特别适用于考察二级结构变化。例如,许多AMPs在磷脂囊泡或LPS等细菌组分存在下,会发生显著的结构转变,由无规卷曲转变为 $α$ -螺旋或 $β$ -折叠(图14)。

更具信息量的是,可利用取向圆二色性(OCD)监测AMPs倾向于在脂质双层表面积累,还是插入脂质双层核心。Huang等研究了表面态(S-state)与插入态(I-state)之间的转变(图13)。在不同P/L比和不同相对湿度条件下,对处于脂质流体 $L_{α}$ 相的取向PC双层膜中的alamethicin进行OCD光谱分析,结果显示多肽排列会在某一特定临界P/L比值处发生转变。当多肽浓度高于P/L时,大多数alamethicin分子以I态插入膜中;而当P/L<P/L*时,大多数多肽结合于膜表面。

有趣的是,该研究显示这种转变具有脂质结构依赖性,其阈值浓度在diphytanoylPC双层膜中为P/L*=1:140,而在1,2-dioleoyl-phosphatidylcholine中为P/L*=1:200。插入态是AMPs的关键特征,其中阈值浓度尤其重要,是建立脂质膜与多肽活性关系的重要生物物理参数。

作为比较,PGLa,MSI-103和MAP这三种AMPs在高水合条件下的dimyristoyl-PC(DMPC)双层膜中进行了研究。结果发现,这些多肽在低P/L时采用S态,而在高浓度下会翻转为一种具有斜向角度的离散倾斜态,但并未接近I态。该倾斜态被命名为T态(T-state),并被归因于二聚体形成。PGLa在P/L*≈1:85时开始翻转,而MSI-103的阈值为P/L*≈1:236。

4.1.2.3 近紫外CD研究:三级结构与局部环境

富含Trp的短肽已显示出纤维状聚集行为,这种现象可通过吲哚发色团在 $240 - 310 n m$ 范围内重叠的 $L_{a}$ 和 $L_{b}$ 跃迁观察到。强度变化表明芴基发生了手性排列,并伴随组装形成纳米纤维。

近紫外CD在AMP研究中的另一项有趣应用,来自对疏水性膜活性肽LAH6的研究。LAH6具有核酸结合能力,这可能是这类多肽作用机制中的一个潜在事件。虽然该研究重点关注核酸信号,但对多肽进行滴定显示,DNA结构会发生凝聚,并呈现S形响应行为。结果还表明,一段15个碱基对的DNA可容纳4至10个多肽,但这一过程具有pH依赖性。考虑到原位环境中不同生理区室之间的差异,这一特征具有重要意义。

图14|magainin 2(左图)或cecropin A(右图)溶液中LPS滴定的CD光谱。

4.1.3 傅里叶变换红外(FTIR)光谱

傅里叶变换红外(FTIR)光谱已被用于分析AMPs与脂质膜相互作用时的构象变化。FTIR测量分子中化学键的振动模式,这些振动模式的变化可反映多肽折叠,膜结合或结构转变,也可反映AMP在相关膜环境中的相对取向,从而为不同相互作用模式提供关键信息。此外,结合二维相关分析后,FTIR可成为揭示多肽与其天然或近天然分子环境之间相互作用机制的有力工具。多个红外区域,包括中红外区(MIR),远红外FTIR(FIR)以及太赫兹(THz)时间域,可区分涉及分子间和分子内氢键的振动模式,从而记录特定分子排列的独特指纹。

4.1.3.1 衰减全反射-傅里叶变换红外光谱

衰减全反射-傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)是一种强大且快速的技术,可用于生物体系的结构表征,包括膜,蛋白质,多肽及其复合物。这种无标记方法能够在一次测量中获得宽光谱范围的信息,捕捉多种化学基团的振动频率。因此,ATR-FTIR非常适合研究分子相互作用,例如AMPs与脂质膜之间的相互作用。

在ATR-FTIR中,红外光束通过由高折射率(RI)且对红外辐射透明的材料构成的内部反射元件(IRE)。在IRE与样品的界面处,光束发生全内反射,产生延伸至样品介质中的倏逝波。该倏逝场随距界面距离增加而呈指数衰减,并与靠近表面的分子发生相互作用。所得吸收光谱反映了倏逝场范围内所有分子振动模式的贡献。

为了研究AMPs与脂质膜的相互作用,通常通过干燥膜囊泡悬液,将取向多层膜沉积在表面上。为了与倏逝场实现最佳耦合,这些膜应具有良好取向,其中磷脂头基平行于IRE表面排列。为了提取溶液中或与膜接触时AMPs的结构信息,主要分析酰胺I带。该谱带主要来自肽键的 $C = O$ 伸缩振动(约76%),并有少量 $C N$ 伸缩振动贡献(约14%)。相比之下,酰胺II带的光谱纯度较低,主要来自 $N H$ 弯曲振动(约43%)和 $C N$ 伸缩振动(约29%)。这些谱带的频率和形状对氢键敏感,因此也对多肽二级结构敏感,可用于区分 $α$ -螺旋, $β$ -折叠和无序结构。

图15|局部环境对AMP Priscilicidin ATR-FTIR信号的影响,显示酰胺I区(1700−1600 cm−1)振动随水含量变化而发生位移,左图为5% w/w,右图为10% w/w,并在不同时间点进行测量。

偏振ATR-FTIR进一步扩展了该技术的用途,可确定二级结构元件相对于膜法线的取向。当跃迁偶极矩与入射光的电场矢量对齐时,吸收达到最大。由于脂质双层相对于IRE表面具有统一取向,偏振测量可揭示肽键的平均取向。具体方法是分别记录入射光平行和垂直于膜表面偏振时的光谱,并计算二色比 $R_{A T R} = A_{/ /} / A_{⊥}$ 。例如,酰胺I带出现负二色比,表明 $C = O$ 偶极优先平行于膜平面取向。

由实验二色比确定多肽取向需要了解多个参数,包括样品折射率(RI),跃迁偶极矩相对于二级结构轴的角分布,以及膜相对于IRE的排列方式。理论建模对于将光谱二色性与分子取向联系起来也至关重要。需要注意的是,在薄膜中,即厚度远小于波长时,倏逝场通常被认为是均匀的;而在较厚样品中,场强会随深度显著衰减,可能无法穿透整个样品厚度。

ATR-FTIR光谱在研究膜相关AMPs方面具有若干显著优势。首先,它是一种相对直接的技术,即使在低浓度条件下,也可确定嵌入脂质单层膜或双层膜中的多肽构象。单层膜可通过Langmuir-Blodgett(LB)转移法制备到锗片等红外透明基底上,双层膜则可通过多种方法组装,包括囊泡融合方法,或对沉积脂质膜进行再水合,其中可加入或不加入多肽。其次,ATR-FTIR可快速且定量地评估膜相关多肽对脂质酰基链有序性的影响,同时确定多肽相对于膜平面的取向。再次,ATR-FTIR对单个氨基酸层面的同位素标记敏感,因此能够在多肽骨架内部获得精确且局部化的结构或环境信息。

利用ATR-FTIR研究了AMP MSI-594及其类似物MSI-594A在两性离子POPC和阴离子7:3 POPC/POPG脂质双层膜中的取向。结果显示,优化后的MSI-594螺旋发夹结构在POPC和7:3 POPC/POPG脂质双层膜中均采用完全结合于脂质双层表面的取向,即“face-on”取向;而MSI-594A在N端和C端螺旋之间表现出更大的弯曲角度,其疏水性C端螺旋插入双层膜的疏水区域,即“membrane-inserted”取向。

ATR-FTIR还可通过监测精氨酸酰胺I带来探测AMPs的局部环境。具体而言,当两个振动峰之间的波数差较小,约位于 $1680$ 和 $1630 c m^{- 1}$ 附近时,表明多肽单体或球状寡聚体中的精氨酸侧链暴露于溶剂中;而当两个振动峰之间的波数差较大时,则表明精氨酸侧链埋藏于疏水环境中。对于AMP priscilicidin而言,IR数据支持多肽自组装体的形成,其中精氨酸侧链嵌入疏水核心(图15)。

4.1.4 UV-vis光谱

紫外-可见(UV-vis)吸收和荧光光谱是研究多肽与膜及其他生物分子相互作用的较简单但信息丰富的方法。虽然这些方法无法提供高分辨率结构信息,但UV-vis和荧光可用于研究AMPs的聚集状态,与靶标的结合亲和力以及光物理性质。

荧光淬灭实验以及Trp等荧光团的溶剂变色位移,可用于研究多肽与不同靶标的结合;而UV-vis则可揭示nisin和polymyxin B等AMPs与LPS或磷脂囊泡的结合亲和力。FRAP/FRET实验可提供多肽聚集或构象转变的信息,但这类实验通常需要在AMP序列中引入特定染料。最后,膜破坏可通过染料释放实验研究,即将猝灭状态的荧光染料装载入脂质体中,当脂质体被AMP裂解后,染料释放并产生荧光。

图16|(A)SPR、(B)PWR、(C)OWLS和(D)DPI的光学构型及数据输出示意图。

4.2 用于多参数实时测量的光学生物传感技术

表面等离子体共振(SPR)一直是探索生物分子与膜结合机制最广泛使用的技术。局域表面等离子体共振(LSPR)在金属表面附近具有更小的倏逝场,也为探测分子-膜相互作用提供了很大潜力。另一种传感技术是双偏振干涉(DPI),其基于集成平面光波导干涉仪,结合倏逝场传感和光学相位差测量方法,其优势是在单次结合实验中实现多参数测量,从而获得吸附层密度和厚度等光学几何性质。这些特征的重要意义在于,可以在分析膜活性多肽和蛋白质对双层膜结构影响的同时,分析结合事件所伴随的质量变化。

生物传感器的微注射和微流控系统可以对介导多肽/蛋白质与膜结合的结构因素和组成因素进行高通量筛选。然而,与其在其他非膜分子结合研究中的应用相比,生物传感器在膜相互作用研究中的使用仍然相对有限。部分原因在于,目前缺乏稳健的原位方案,难以在生物传感器芯片上构建稳定可靠的膜体系,同时也难以提供膜整体几何性质的信息。尽管如此,已经开发出若干光学生物传感器,如图16所示,可用于研究生物膜形成,并确定固定化或物理吸附在传感器芯片上的人工细胞膜和天然细胞膜的几何性质,包括单位面积质量、厚度、密度以及分子堆积状态。

4.2.1 表面等离子体共振(SPR)

SPR是最早用于膜相互作用分析的光学生物传感器之一,多项研究已经对多肽-膜相互作用的动力学和亲和力进行了详细分析。因此,分子相互作用事件中的浓度测量以及动力学参数,包括结合和解离过程,已被广泛用于阐明结合机制。SPR光谱在所研究的膜体系方面也具有较高灵活性,可应用于基于生物膜的体系,包括平面单层膜、平面双层膜或脂质体。

Kretschmann棱镜耦合表面等离子体激发与传感的光学构型由覆盖薄金属膜(Au或Ag)的棱镜组成(图16A)。入射光在特定共振角和光学波长组合下激发表面等离子体,并产生沿金属-介电界面平行方向传播的表面电磁波。反射率对角度的依赖关系称为SPR光谱,在共振条件下会出现非常尖锐的反射率下降。入射光在金属薄膜上的全内反射会在介电-金属界面附近产生倏逝场,形成对折射率(RI)敏感的传感体积,其场强从表面向外逐渐衰减。

在介电-金属界面上形成的分子层会与倏逝场相互作用,从而改变共振激发过程。这会导致金属膜反射光强发生变化,并可通过反射角位移进行测量。芯片表面脂质双层膜的形成以及随后分子与脂质双层膜的结合,均可被实时表征,从而为研究多肽-膜相互作用以及配体-受体结合的亲和力和动力学提供平台。

4.2.2 单参数测量与多参数测量

包括SPR在内的大多数技术,均基于广泛使用的倏逝波方法,在一次独立实验中提供单一参数测量。因此,这些技术获得的数据主要局限于测量随时间变化的共振角位移所反映的质量相关变化。然而,与膜的相互作用不仅涉及多肽结合到膜上所引起的质量相关变化,也涉及这种结合对膜结构造成的影响。单次测量得到的质量响应可能会受到结构变化的增强或抑制,例如膜的横向扩张或压缩。对于脂质双层膜这类各向异性体系而言,此类结构变化可能非常复杂,如果没有特异性标记,通常难以测量。

为了利用光学生物传感器解析结合促进的结构变化,可采用固定波长下两个彼此独立且正交的偏振场,或采用不同光学波长下的两个倏逝场,从实验上确定均匀各向同性薄膜的两个光学几何参数,即平均RI和厚度。不同构型的波导型光学传感器采用了这两类设计原则之一,以获得层结构信息,进一步研究膜结合相关的动态构象变化。这些方法包括等离子体波导共振光谱(PWR)、光波导光模式光谱(OWLS)和DPI。三种技术的物理基础在图1中以示意图形式呈现,并在下文进行说明。

4.2.3 等离子体波导共振光谱

等离子体波导共振(PWR)光谱是Kretschmann型SPR构型的一种变体,涉及更复杂的组装结构。在这种结构中,薄金属银膜中的SPR与介电二氧化硅覆盖层中的导波耦合,从而同时激发表面等离子体共振和波导共振(图16B)。对于脂质-蛋白质体系等薄膜材料,其光学性质,包括厚度 $(t)$ 和复介电常数,即RI $(n)$ 和消光系数 $(k)$ ,可通过p偏振和s偏振光组分激发产生的表面共振获得。通过非线性最小二乘分析,将理论响应曲线拟合到实验曲线,可从光谱中唯一评估 $t$ 、 $n$ 和 $k$ 值。

这些参数使得直接监测脂质双层膜,包括脂筏的形成过程和质量评估成为可能。该技术主要应用于膜结合受体,例如G蛋白偶联受体(GPCRs),并提供了关于动态受体构象变化的认识。这些构象变化与不同配体作用于同一GPCR时脂质分子厚度和分子堆积状态的变化相关。PWR还可分别在p偏振和s偏振条件下测定配体与GPCR结合的动力学和热力学,以及与GDP/GTP交换相关的G蛋白-GPCR相互作用。

然而,对于由多种分子相互作用模式产生的复杂光谱而言,这种拟合分析并不能唯一确定光学参数。这些分子相互作用可能涉及多个构象,并以连续方式或平行事件序列的方式发生。为了表征复杂光谱,通常需要采用光谱模拟或图形分析,以解析脂质双层膜中分子相互作用诱导的质量变化和结构变化。光谱模拟已被用于获得脂质膜的结构参数,如厚度、每个脂质分子的平均表面积、长程分子有序程度,以及支持脂质双层膜中脂质和蛋白质在微结构域中的横向分离。

图形分析则将s偏振和p偏振激发获得的等离子体-波导共振光谱位移,从 $(s - p)$ 坐标系转换为质量-结构各向异性坐标系。与光谱拟合程序相比,这种方法可以更简单、更快速地区分蛋白质-脂质双层膜薄膜中发生的质量变化和各向异性变化。图形方法可用于解析体系中与质量和结构变化相关的多事件复杂序列,而这是光谱拟合程序无法完成的。

这种分析已用于多肽诱导脂质双层膜破坏的研究。例如,细胞穿透肽penetratin与磷脂eggPC和eggPC/DOPE结合时诱导的光谱位移显示涉及两个结合过程,其中第一个事件以质量变化为主,第二个事件则归因于质量变化(80-90%)和结构变化(20-10%)。结构变化包括双层膜厚度、各向异性和平均折射率的变化。PWR还被用于研究一种细胞穿透肽以及其他膜活性肽的膜相互作用。总体而言,这些研究为理解细胞穿透肽在穿越脂质双层膜过程中如何改变膜结构提供了新的认识。

4.2.4 光波导光模式光谱

在光波导光模式光谱中,光栅与平面光波导耦合,偏振光从光栅发生衍射,并通过介电平板波导内部的内反射传播(图16C)。该波导被设计为当偏振光以特定入射角激发波导时,可同时激发零级横电(TE)和横磁(TM)偏振模式。TE和TM共振角彼此分离,并可由这些角度计算TM和TE模式的有效RI。由于模式的倏逝光波延伸至波导覆盖层中,表面分子吸附会导致每一种TM和TE偏振模式的入射角发生位移,这种位移可被实时定量监测,用于动力学分析。

沉积层的光学几何性质,即厚度和RI,可通过对波导体系求解三层模式方程,由测得的有效RI提取。吸附分子层的单位面积质量,即质量密度,可由厚度和RI计算得到。由硅钛氧化物 $(S i_{x} T i_{1 - x} O_{2})$ 制成的光栅耦合光波导通常通过溶胶-凝胶技术制备。 $S i O_{2}$ 、 $T i O_{2}$ 、 $T a_{2} O_{5}$ 、ITO、 $Z r O_{2}$ 和 $A l_{2} O_{3}$ 等材料也已用于传感器表面涂层,并适用于多种化学和生物化学功能化。

光学几何参数的计算通常假设吸附层是均匀且各向同性的。然而,脂质双层膜是光学各向异性体系,具有单轴光学轴,并包含两个不同的主折射率,即非常光折射率 $(n_{e})$ 和寻常光折射率 $(n_{o})$ 。利用光波导测量 $n_{e}$ 与 $n_{o}$ 之间的差异,即光学双折射,可在亚纳米尺度研究吸附生物薄膜的内在结构,因为膜的光学双折射反映了其结构组织水平。

OWLS已被用于表征脂质囊泡在光滑金属氧化物表面的吸附,以及具有不同烷基链的磷脂双层膜的光学各向异性。它还可以测量脂质双层膜的光学几何参数,包括厚度、RI和各向异性随温度的变化。通过OWLS测得的平面磷脂DMPC双层膜主相变温度约为 $24^{\circ} C$ ,与量热法获得的数值一致。OWLS能够测量脂质双层膜结构性质,因此为研究药物的膜分配行为、多肽激素的剂量响应、多肽和蛋白质与双层膜结合的动力学,以及通过整合跨膜受体研究配体-受体相互作用提供了有用方法。

4.2.5 双偏振干涉

在DPI中,集成平面光波导干涉仪由具有两条光路的器件构成,可结合倏逝场传感测量光学相位差(图16D)。进入干涉仪波导结构的光会同时通过传感路径和参考路径。Young干涉和Mach-Zehnder干涉这两种不同构型,均利用光的波动性质检测样品光学性质的变化。

在典型的集成光学干涉仪中,采用Mach-Zehnder构型的两束光发生干涉,并在到达光电探测器之前被引导至同一路径进行重组。因此,光强与两束干涉波所得振幅的平方成正比。在Young干涉仪中,来自传感路径和参考路径两条狭缝的出射光被投射到探测器阵列上,形成干涉图样,并由高分辨率记录器捕获;这不同于PWR和OWLS中由光电二极管检测信号强度的方式。

与光在同一波导路径上传播的共路波导干涉仪不同,DPI采用双光路Young干涉仪构型,其中波导模式在两个垂直堆叠的单模波导层中传播,这两个波导层分别为传感波导层和参考波导层,中间由包层材料隔开。参考波导埋置于下包层中,而传感波导通过与分析物直接接触来采样环境。固定波长激光发出的偏振光同时通过两个波导,在远场产生干涉图样,并由CCD相机检测。通过傅里叶变换将强度与位置相关联,连续监测条纹图样的相对相位位置,可直接测得相位变化。

相位变化与传感波导有效RI的变化相关,因此可通过光的倏逝场与表面上方材料的相互作用,检测传感波导上表面以上的变化。不同于仅利用TM偏振的SPR,DPI配备偏振切换器,可依次测量TM和TE偏振。对于由均匀多层介电层组成的体系,可利用Maxwell电磁方程,由每种TM和TE偏振的绝对有效折射率解析各层的RI(或密度)和厚度。

生物薄膜体系的光学各向异性也可能导致DPI中厚度值被高估。在这种情况下,已发展出双折射分析,用于测量吸附脂质双层膜在形成过程中以及被膜活性多肽和蛋白质去稳定化过程中出现的结构组织变化。总体而言,这些光学传感器具有特定优势,可以从一系列动态结构参数方面完整表征单个脂质双层膜体系,包括厚度、单位面积质量密度、每个脂质分子的表面积以及分子取向有序性,即双折射或各向异性。

能够准确测量脂质分子的取向有序性是这类技术的独特特征,可用于检测和追踪脂质双层膜结构变化,从而更深入理解生物分子结合到生物膜后产生的影响。流通式系统还支持对结合过程和膜破坏过程进行实时动力学分析。由于双折射可量化脂质分子在平面表面上的取向程度和单轴堆积程度,因此膜结合过程中双折射随多肽结合而发生的变化,可为理解结合机制以及脂质堆积、结构域形成和膜去稳定化中速率依赖和浓度依赖的变化提供独特信息。

4.2.6 脂质单层膜研究

虽然双层膜研究为全面表征AMP-膜相互作用的分子细节提供了机会,但单层膜研究是早期理解膜行为的基础。掠入射X射线衍射(GIXD)可提供体相双层膜测量难以获得的平面内分子组织信息,分辨率可达埃级;而X射线反射和中子反射则可提供互补的平面外结构轮廓,精度可达亚埃级。与双层膜体系相比,单层膜允许在生理相关的横向压力下控制表面压力和分子堆积密度,因此适合用于探测AMP选择性和插入能量学。

例如,针对protegrin-1的GIXD和X射线反射研究表明,该多肽容易插入阴离子脂质单层膜,但与两性离子脂质的相互作用很小。在细菌膜模拟体系中,GIXD通过Bragg峰消失显示晶体堆积被完全破坏。类似方法也确立了LL-37的选择性。X射线反射揭示了阴离子脂质中层厚度和电子密度的显著变化,而GIXD进一步证实,与DPPC和DPPE单层膜相比,LL-37特异性破坏DPPG单层膜中的横向堆积有序性。这些研究为脂质头基识别提供了直接的结构基础,并与双层膜实验形成互补。

较新的研究将单层膜和表面散射方法扩展到具有临床相关性的耐药机制。Martynowycz及其同事结合GIXD和镜面X射线反射,证明Salmonella脂质A修饰可阻止LL-37穿透。GIXD显示,多肽暴露后LPS单层膜中的晶体结构域减少;反射率轮廓则显示,脂质A的化学修饰会阻断多肽进入疏水核心。关于polymyxin B与Escherichia coli外膜模型相互作用的互补中子反射研究表明,LPS层的物理状态对抗生素敏感性具有关键影响,只有在LPS层紧密堆积时,才会发生膜破坏。

采用同位素对比变化的中子反射进一步证明,该方法对于以分子精度确定多肽定位和取向至关重要。对富含Aib的peptaibols的研究利用中子反射定量分析插入深度和多肽取向,并将Aib诱导的螺旋性与膜分配行为联系起来。最近,结合散射和时间分辨测量的研究对传统成孔模型提出了挑战,显示抗菌肽可通过瞬态水通道使膜通透化,而不一定形成稳定的跨膜孔。

图17|AFM系统示意图。 探针的移动由扫描器控制,扫描器通过反馈回路由控制器调节。控制器接收来自快速四象限位置敏感光电二极管(PSPD)的信号,PSPD检测来自蚀刻在探针末端悬臂背面的反射激光光。探针在样品表面进行光栅扫描(系统性逐行横向移动)时,会随高度变化而调整,并经过处理生成支撑在固体基底上的样品拓扑图像。

4.3 AMPs诱导的膜形态与结构组织动态变化的AFM成像

4.3.1 AFM仪器

不同光谱技术获得的膜中多肽构象动态信息,为理解AMPs膜去稳定化活性背后的多肽折叠和能量学提供了详细认识。同时,直接成像多肽诱导的膜破坏过程也十分重要,因为这有助于进一步理解膜破坏的不同途径。膜结构高度动态,不同相可共存,并表现出不同的分子有序性。这些分子有序区域通常被表征为膜结构域或脂筏,并与特定脂质种类相关的独特功能有关。

尽管X射线晶体学和冷冻电子显微镜(CryoEM)等原子分辨率技术广泛用于结构分子生物学领域,并已为大型膜蛋白提供了详细结构数据,但这些技术并不容易用于分析动态膜双层结构。尽管如此,冷冻电子断层扫描(Cryo-ET)现在已经能够直接观察AMPs对完整细菌细胞的作用。Chang及其同事观察了pepD2M诱导的Escherichia coli膜破坏过程,为类似去污剂机制提供了细胞尺度的直接证据。在更高分辨率层面,单颗粒CryoEM已经获得了与上述机制模型直接相关的近原子级孔复合物结构。Johnson等解析了由52个原聚体组成的细菌gasdermin孔,分辨率达到 $3.3 Å$ 。Dickey等描述了TMcin这一新型AMP类别,其可形成稳定的 $β$ -桶状孔;而van Pee等解析了pneumolysin孔复合物,分辨率为 $4.5 Å$ 。

然而,随着能够在纳米级分子分辨率下探测结构、物理和机械性质的分子成像技术不断发展,对膜结构以及膜活性多肽诱导的膜破坏的理解得到了极大拓展。自1986年Gerd Binnig首次发展AFM以来,AFM已成为一种多参数成像平台。Gerd Binnig因发明扫描隧道显微镜(STM)而获得诺贝尔物理学奖。AFM可提供皮牛顿级力灵敏度和纳米级分辨率,能够在天然状态或生理环境中观察膜结构的动态变化,且无需特异性化学标记或探针。

AFM装置的关键组成部分如图17所示,包括位于柔性微悬臂末端的尖锐探针。悬臂蚀刻在宏观探针上,并可牢固夹持在压电定位器上。探针尖端半径为纳米级,可制备成不同尖锐程度和长度,并决定样品结构特征的横向分辨率和深度。高分辨率结构成像和机械性质表征通常会选择不同类型的AFM探针。半径为 $2 - 5 n m$ 的尖锐圆锥形探针常用于获得更高结构分辨率,而半径较大的钝球形探针,通常尖端半径为 $50 - 100 n m$ ,可降低施加到样品上的应力,因此常用于软生物样品的机械表征。

微悬臂通常由硅或氮化硅晶片制成,具有不同几何形状、长度、厚度(频率)和刚度(弹簧常数)。悬臂规格的选择取决于具体应用、所需灵敏度、操作模式、样品性质和扫描速度。悬臂背面通常涂覆金、铝、铬或铂等光反射层,激光束通过光学系统聚焦于该层。在AFM的基本形式中,其工作原理是在探针扫描样品表面时测量纳米级探针与样品之间的作用力,并捕获形成于固体基底上的分子层结构轮廓。

探针与样品表面的相互作用会影响悬臂的运动和弯曲。探针对样品表面进行光栅扫描,可探测表面性质变化,例如高度、刚度、黏附性和电学性质等。这些变化会改变探针-样品相互作用,进而导致悬臂偏转,或导致振荡幅度、频率和相位发生变化。探针-样品相互作用由快速四象限位置敏感光电二极管探测器(PSPD)精确感知。扫描前,PSPD各象限输出光电压之间的差值 $(D V)$ 被设定为零。探针-样品相互作用过程中悬臂发生偏转,使反射激光以略有不同的角度返回,并改变 $D V$ 值。由于 $D V$ 与悬臂偏转成正比,因此可通过处理器测量 $D V$ 来实时监测探针-样品相互作用。

信号处理器和悬臂连接至反馈控制单元,该单元可根据探针与样品之间局部作用力的差异对表面进行成像。快速反馈控制环用于维持用户定义的探针-样品作用力,这一作用力也称为设定点。该反馈系统对于校正信号误差十分重要,这些误差来自悬臂偏转导致的反射光变化,即PSPD偏离设定点。偏转、幅度、频率或相位中的误差信号可通过反馈环路校正,具体方式是向压电扫描器发送电压信号,以修正探针-样品距离。合理调节设定点和反馈电路对于控制探针至关重要,可使探针对样品表面进行光栅扫描,并获得高质量拓扑图像。

4.3.2 AFM分析模式

传统上,AFM模式根据探针在样品上方的运动方式、相互作用类型和测量方式,可分为静态模式和动态模式。这些所谓的主要模式已被广泛用于表征表面形态,从而提供表面的纳米级三维结构域信息。随着应用范围和材料类型不断扩展,AFM方法和仪器持续改进,通过一种或多种特定改造或方法实现多参数获取。目前已有超过50种AFM模式被开发出来,并可根据结构、电磁、机械、化学、电化学性质以及热响应进行分类。

最早的AFM采用接触模式,属于一种静态模式,通常用于测量生物分子的表面形态和机械性质。动态模式包括敲击模式和PeakForce Tapping(PFT)模式,它们与接触模式一起被广泛用于评估样品拓扑结构,并构成其他AFM模式的基础。在多种AFM模式中,接触模式、敲击模式和PFT模式被广泛用于表征生物膜的结构域和热相行为。

在接触模式中,探针在对样品表面进行光栅扫描时始终与样品保持接触。反馈环通过垂直移动扫描器来维持恒定偏转,从而保持力设定点恒定。该模式被认为是一种快速成图模式,适用于空气、真空和液体等多种条件,并可用于高分辨率成像,分辨率可达到原子晶格水平,也可用于力测量。然而,施加在探针上的力可能会损伤样品表面,横向力和黏附力也可能降低图像空间分辨率。因此,接触模式可能受到高剪切力和成像力的限制,这些力会造成探针磨损,并在力大于 $100 p N$ 时导致软生物样品发生不可逆变形。

尽管接触模式存在不可逆损伤的缺点,但它仍已用于获得单个膜蛋白的高分辨率表面拓扑图像,横向分辨率可小于 $1 n m$ ,垂直分辨率可小于 $0.1 n m$ 。利用接触模式进行高分辨率时间序列扫描,可描绘细菌外膜蛋白功能机制中的动态变化、磷脂酶A2降解磷脂双层膜的过程,以及amylin纤维组装的动态行为。

由于接触模式中较大的横向探针-样品作用力会导致样品损伤并引入伪影,因此常使用敲击模式和PFT模式等动态模式,以克服接触模式中破坏性摩擦力、静电干扰、毛细作用和黏附所带来的问题与限制。在敲击模式中,悬臂通常借助压电晶体在悬臂共振频率附近振荡,频率通常为数十至数百kHz。在给定振荡幅度下,敲击探针可在吸引力和排斥力区域内感知长程van der Waals力。扫描过程中,振荡探针以 $50000 - 500000$ 次/秒的频率间歇接触样品表面。当探针接触样品表面时,由于探针-样品相互作用造成能量损失,振荡必然减弱,从而导致振荡幅度降低。扫描过程中这种幅度降低可用于识别和测量表面特征。

敲击模式中的反馈环设定点基于振荡参数,例如幅度、频率或相位。悬臂振荡幅度会随施加于样品的力发生变化。该幅度用于反馈环,通过 $z$ 轴运动维持恒定的探针-样品距离,从而直接测量样品高度并决定图像质量。扫描过程中悬臂振荡相位也会发生变化。可基于相对于正弦驱动波的相位位移构建图像,并提供表面黏附性、弹性和黏弹性等特征性质。然而,由于所有这些机械性质都会影响相位位移,因此无法从相位图像中提取单独的机械性质。

PeakForce Tapping模式与敲击模式类似,都通过间歇接触样品来避免横向力导致的样品损伤。与敲击模式中悬臂调谐至高共振频率不同,PFT模式中悬臂在远低于共振频率的条件下振荡,悬臂的垂直运动使用主要的 $Z$ 压电元件,并依赖峰值力进行反馈。因此,该模式无需进行悬臂调谐,避免了共振系统的滤波效应和动力学影响,在液体环境中尤其具有优势。与Force Volume成像模式中由压电管驱动的传统力曲线所采用的三角波不同,PFT的 $z$ 位置由正弦波调制,振幅通常为 $100 - 300 n m$ ,每一次敲击都会生成一条力-距离曲线。连续力曲线可在 $0.5 - 10 k H z$ 频率范围内执行。每一次独立敲击都可收集样品的峰值相互作用力和多种机械性质,并以逐像素图像形式显示。

对于每一次探针-样品相互作用,正弦调制与背景扣除的结合使PFT在往返点避免了共振噪声,并消除了环境阻尼或粗糙样品拓扑结构导致的背景偏转信号影响。PFT模式还实现了扫描参数自动优化,包括增益、设定点和扫描速率。PFT模式成像的分辨率可通过控制探针-样品相互作用力,即力设定点,进行精细调节,从而改变变形深度,同时使探针与样品之间的接触面积最小化。在低力条件下可获得高分辨率拓扑图像,并减少变形深度,最大限度降低样品损伤和探针磨损。

PeakForce-Quantitative Nanomechanical Mapping(PF-QNM)模式是PFT模式的扩展。在该模式下,力曲线可用Hertz-Sneddon模型、Derjaguin-Muller-Toporov(DMT)模型或Johnson-Kendall-Roberts(JKR)模型等机械模型进行拟合,从而获得多种机械性质图谱。这使得在与高度图像相同分辨率下,定量测量纳米尺度Young模量(刚度)、黏附、变形和能量耗散成为可能。这些纳米机械性质图和拓扑图可将动态分子结构与可同时定量分析的性质和功能联系起来,这一点已在吸附于云母上的紫膜和红细胞质膜研究中得到展示。

4.3.3 高速AFM

通常,膜环境中生物分子的动态结构变化和横向运动可发生在纳秒至分钟尺度。如上所述,这些动态结构变化可通过全内反射荧光显微镜和NMR等光谱技术进行分析。荧光显微镜可生成图像速率为30帧/秒的视频。然而,这些荧光图像的空间分辨率远低于AFM,而在其他光谱分析中,动态分子过程通常作为平均变化进行分析。传统基础AFM模式的扫描速率显然过慢,无法捕捉发生在毫秒或更短时间尺度上的生物分子快速动态行为。单张图像采集通常需要数十秒至数分钟,这一时间过长,无法捕捉抗菌药物、多肽或蛋白质相互作用时膜结构和组织的瞬时变化。

因此,经过扩展改造的高速AFM(HS-AFM)被开发出来,其可将扫描速度从每张图像数分钟大幅缩短至毫秒级。为提高反馈控制器中所有部件的响应速度,已经发展出多种装置和技术。HS-AFM发展的主要技术进步首先包括短悬臂的微加工,其长度缩短至 $7 μ m$ ,宽度缩短至 $2 μ m$ ,厚度缩短至 $90 n m$ ,弹簧常数较小,约为 $0.1 - 0.2 N / m$ 。相比之下,传统悬臂长度为 $40 - 200 μ m$ ,宽度为 $20 - 30 μ m$ ,厚度为 $400 - 800 n m$ 。尺寸和质量的降低显著提高了悬臂在水中的共振频率,可达到 $0.8 - 1.2 M H z$ ,响应时间约为 $1 μ s$ 。

第二项创新是采用两个相同的压电致动器,以相反方向放置并同时驱动,从而抵消由高共振频率驱动的 $Z$ 扫描器产生的不利振动。第三,采用傅里叶方法在每一个振荡周期测量悬臂振荡幅度。最后,自适应/动态比例-积分-微分(PID)控制器在拓展带宽的同时最大限度降低敲击力。这可防止探针-样品相互作用在样品下坡区域丢失,避免产生被称为“降落伞效应”的水平划痕,同时不会导致反馈控制延迟。

典型HS-AFM能够以 $10 - 20$ 帧/秒(fps)成像蛋白质分子,最先进的HS-AFM目前可在约 $250 n m$ 扫描范围和约100条扫描线条件下,达到 $30 - 60 m s / f r a m e$ 的采集速度。HS-AFM已被用于展示多种动态作用过程,例如bacteriorhodopsin对交替照明的动态响应、myosin V在肌动蛋白丝上的行走,以及脂肽daptomycin诱导细菌膜变形的过程等。

4.3.4 生物膜的AFM分析

生物化学方法、生物物理表征与计算方法的结合,揭示了脂质组分化学多样性所关联的非凡物理性质。多数生物物理方法,例如光谱和散射技术,主要提供膜的平均结构和物理性质信息。然而,局部结构和物理性质的细节现在正通过高分辨率成像技术得到表征。膜及嵌入膜蛋白的高分辨率静态结构可通过EM和CryoEM进行分析。结构重组的动态行为可通过常规荧光成像技术研究,但这些技术受限于较低分辨率,通常约为 $100 n m$ ,并且膜双层中的化学探针可能引入扰动。

相比之下,AFM能够在生理环境中于单分子水平成像生物分子,无需固定样品,也无需化学标记或探针,因此非常适合探索脂质种类组成变化的影响,以及各种细胞状态和AMPs等外部刺激响应中,物理和机械性质如何与动态时空结构转变相关联。AFM的纳米级分辨率和毫秒级高速成像能力,使其成为研究生物膜结构和功能的重要技术。通过整合从多种模型膜体系的其他光谱和荧光分析中获得的信息,可进一步加深对膜结构域复杂时空行为及其调控AMPs活性作用的理解,并推动AMPs作用机制的定量建模。

在各种模型膜和天然细胞膜中,物理吸附的支持脂质双层膜(SLBs)非常适合AFM成像分析,并已被广泛表征。为了阐明膜响应外部应力时的时空结构动态,获得平滑、均一且稳定的SLBs非常关键,而稳健的制备方法对于获得结构性质高度可重复的SLBs同样至关重要。用于AFM成像的SLBs主要制备方法包括Langmuir-Blodgett(LB)和Langmuir-Schaefer(LS)沉积,可用于受控不对称双层膜;囊泡吸附-融合方法,便于操作;以及将脂质旋涂到预处理支撑物上的方法。

即便SLBs由相同脂质种类组成,其脂质双层拓扑结构仍可能存在差异,包括不同相的高度变化、不对称叶层耦合和波纹相等。缓冲液类型与组成、沉积温度和孵育时间、脂质体尺寸和浓度、基底性质、沉积过程中的加热-冷却平衡程序以及 $C a^{2 +}$ 浓度,都会影响SLBs最终的结构、相分离和叶层不对称性。为了考察多肽引起的膜结构和形态变化,在加入多肽之前,需要首先稳定并充分表征脂质双层膜的结构和相状态。

早期通过囊泡融合形成单一连续双层膜的应用,推动了AFM广泛用于研究固体支撑物上经囊泡吸附形成脂质双层膜的动力学,并用于观察磷脂混合物相行为,这些混合物可形成纳米至微米尺度的结构域,例如DOPC/DPPC、DOPE/DPPE、DOPE/DSPE,以及含有3种或4种脂质的更复杂混合物和从细胞中提取的天然脂质。AFM研究磷脂膜相分离显示,液态有序相 $(L_{o})$ 或凝胶相 $(L_{β})$ 的微观结构域通常比液态无序相 $(L_{d})$ 结构域更高。在 $10 - 20 m M$ $C a C l_{2}$ 存在下,对于模拟Escherichia coli内膜脂质组成的POPE:POPG,摩尔比为3:1, $L_{o}$ 与 $L_{d}$ 之间的台阶高度差可为 $0.5 - 3.0 n m$ 。

在其他研究中,微生物膜模拟体系也报道了三个由不同厚度值定义的独立结构域,其厚度差为 $0.5 - 0.7 n m$ 。这些混合物包括POPE:POPG(3:1),等摩尔比的DMPC:DMPG(3:2)/POPC:POPG(3:2)/DPPC:DPPG(3:2),以及在静止生长期重构的Escherichia coli内膜。这些台阶高度差异与线张力有关,即结构域边缘界面能对 $L_{o}$ 结构域组织和稳定性的影响。固体支撑物上结构域形成的温度、尺寸和动态分布强烈依赖于 $L_{o}$ 与 $L_{d}$ 结构域之间的疏水错配,并且当无序相相对于有序相的酰基链长度缩短时,高度差可进一步增大。

在多组分SLBs中,不同相的厚度也会随叶层对称性而变化,而叶层对称性高度依赖于制备温度,因为制备温度会调节结构域边界处的横向压力。膜中微米/纳米结构域的存在是研究重点之一,因为这些结构域在响应毒素和膜活性多肽等外部应力时具有多种功能作用。因此,用于AFM成像的SLBs制备条件需要根据不同膜结构性质进行调节,以解析AMPs对膜中特定脂质组织的作用。