Adv. Sci. 2026 | TarPass: 面向靶点的 de novo 分子生成探索——介于理性设计与“德州神枪手”策略之间
今天介绍的是发表在 Advanced Science 上的一项研究工作。该研究围绕“靶点感知分子生成模型是否真的理解靶点信息”这一核心问题，提出了 TarPass 基准，用 18 个研究充分的蛋白靶点、专家标注关键相互作用和实验活性分子，对 15 种代表性模型进行系统评估。结果显示：3D in situ 模型在蛋白-配体相互作用上平均略有优势，但很多情况下并未显著优于随机采样；非3D模型在药物相似性和可合成性上更好，但靶点特异性偏弱；优化类方法可提升单一指标，却常牺牲其他药物性质（如 Lipinski 规则符合性）。论文据此指出当前方法在细粒度靶点约束学习上仍有限，并建议采用分层虚拟筛选后处理流程，先保证分子合理性，再提升靶点相关相互作用，以增强真实药物发现中的实用性。
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0 摘要
靶点感知分子生成模型在药物发现中展现出良好前景，但目前尚不清楚这些模型是否真正利用了靶点信息，还是仅类似于“得州神枪手谬误（Texas Sharpshooter fallacy）”——即对生成结果进行事后合理化解释。为解决这一问题，提出了TarPass基准。该基准包含一个经过整理的数据集，涵盖18个研究充分的靶点，并结合专家标注的关键相互作用以及实验验证的活性化合物，从而能够对靶点感知de novo分子生成模型进行公平评估。针对15种具有代表性的模型进行了评估，覆盖三类范式：非3D模型、3D in situ模型以及基于优化的方法。评估指标包括蛋白-配体相互作用（protein-ligand interactions，PLIs）、分子合理性以及类药性。结果表明，3D in situ模型在预测PLIs方面具有有限的平均优势。然而，许多模型甚至未能优于随机采样。非3D模型由于受益于更广泛的预训练，能够生成更具类药性且更易合成的分子，但其靶点特异性较弱。基于优化的方法能够有效将输出重新引导至对单一性质更有利的化学区域，但通常会以牺牲其他性质为代价，例如降低对Lipinski规则的符合程度。综合这些观察结果，提出了一种面向靶点感知分子生成的多层级虚拟筛选工作流程，作为一种后处理策略，用于富集具有更优PLIs与更高合理性的分子。总体而言，当前模型在捕获细粒度靶点特异性约束方面的局限性，并为未来基于结构的药物设计提供了标准化评估框架。
1 引言
药物发现早期阶段仍然是一项成本高昂且充满不确定性的工作，因为生物活性化合物的识别通常需要对大规模化学库进行广泛筛选。近年来，生成模型逐渐成为加速这一过程的变革性工具，能够高效探索化学空间，并提出超越现有数据库枚举范围的新型分子。近年来，生成模型逐渐成为加速这一过程的变革性工具，能够高效探索化学空间，并提出超越现有数据库枚举范围的新型分子。在这些方法中，靶点感知方法占据了独特位置：其并非通过对化学空间进行无约束探索或依赖高通量筛选来生成分子，而是显式整合蛋白质靶点信息以引导分子生成。这一范式有望通过嵌入来源于靶点的结构与功能约束，提高生成候选分子的生物学相关性，从而将搜索范围缩小至更有可能形成有效蛋白-配体相互作用（protein-ligand interactions，PLIs）的化合物。
当前靶点感知分子生成方法大致可分为三类范式。第一类为3D in situ模型，也是目前的主流方法。这类模型直接基于蛋白口袋结构进行操作，通过扩散模型、流匹配（flow matching）或自回归原子放置等技术，在三维空间中构建配体。尽管此类模型能够显式编码空间互补性，但其依赖高质量结构输入，并具有较高计算成本，因此在可扩展性与泛化能力方面存在一定问题。第二类为非3D模型。这类方法不显式依赖结构几何信息，而是利用靶点结构信息或其他模态信息，例如序列嵌入或代理目标（proxy objectives），生成二维分子图、化学字符串或自定义化学模块。此类方法具有较好的适用范围和计算效率，但由于缺乏结构层面的约束，其可解释性受到限制，并可能影响真实结合模式的恢复能力。第三类为基于优化的方法。这类方法建立在3D in situ模型或非3D生成器基础之上，通过引入事后优化目标，包括强化学习、代理亲和力预测器或偏好对齐（preference-alignment）策略，对生成结果进行进一步优化。尽管这些技术能够将采样过程引导至更符合需求的化学空间区域，但由于其依赖并不完美的评分函数，往往会增加多目标优化的复杂性，并存在过拟合风险。这些问题表明，当前仍难以区分模型是否真正学习到了靶点特异性信息，还是仅仅受到了优化过程所诱导的伪相关影响。
图1｜ a. 靶点感知de novo分子生成的三类范式。b. TarPass基准工作流程示意图。首先，对生成分子进行有效性检查，并组织为包含足够数量唯一分子的集合。随后，将这些分子集合输入对接模块进行初步分子对接。之后，将分子集合与对接结果共同输入评估阶段，分别由MoleEval与DockEval计算相关性质与评估指标。最后，将结果输入分析模块进行综合评估。分子结构采用PyMOL（PyMOL Molecular Graphics System，Version 3.1.0，Schrödinger, LLC，open-source build）进行可视化。
尽管近年来取得了诸多进展，但在评估靶点感知生成模型实际效用方面仍存在关键缺口。理想的模型应能够整合靶点特异性信息与学习得到的先验知识，从而捕获支配蛋白-配体识别过程的生物物理学原理，并进一步生成化学上合理、具有类药性的分子，以支持真实药物发现过程中的理性设计。然而，当前评估指标通常仅局限于测试集上的对接分数统计结果以及类药性指标，而这些指标本质上只是PLIs与生成分子有效性的粗略替代指标。
这些评估方式常因过度依赖经过选择性的案例分析而受到质疑，因为其往往是在结果产生之后对模型能力进行事后合理化解释，从而存在引入“得州神枪手谬误（Texas Sharpshooter fallacy）”的风险，即基于被选择性强调的数据得出结论。尽管对所有生成分子进行实验验证并不现实，但仍有必要先通过计算筛选，再对具有代表性的分子子集进行针对性验证。然而，如果模型无法展现出相比于从现有分子数据库中随机抽取同等规模样本更优的富集能力，那么其额外计算成本便难以得到合理解释。这表明，亟需建立一种基于研究充分且独立于训练数据的靶点基准框架，从PLIs与分子合理性两个层面对模型进行整体评估，从而为药物发现中的模型性能与实际应用价值提供更加稳健的衡量标准。
重新审视现有基准后可以发现，这些基准仅对上述两个关键维度提供了部分覆盖。对于PLIs而言，大多数基准主要关注对接分数，而忽略了不同靶点间更广泛的相互作用模式，Durian即为典型例子。尽管CBGBench尝试解决这一问题，但其对相互作用的分析仍主要局限于结构相似性，因此从药物化学角度来看可解释性有限。在分子合理性方面，现有基准主要依赖传统类药性过滤规则以及来源于GuacaMol和MOSES等二维基准的集合层级指标。较少有基准在二维层面系统评估分子合理性，并同时将活性化合物作为参考标准。一些基准，例如Sanjrani等人的工作，已经通过引入真实世界测试靶点向这一目标迈进。然而，大多数基准仍然以3D in situ范式为核心，而这类方法的结果往往存在严重的构象合理性问题。尽管少数研究已经意识到这一局限，并纳入非3D方法进行比较，例如POKMOL-3D以及Zheng等人的工作，但由于覆盖范围与代表性有限，其评估结果难以具备充分稳健性。此外，缺乏标准化基准协议进一步加剧了不确定性。由于不同研究采用的实践方式并不一致，因此难以区分模型究竟是真正学习到了靶点特异性信息，还是仅仅进行了事后合理化解释。
TarPass基准，用于对所有范式下的靶点感知de novo分子生成模型进行公平且全面的评估，并模拟其在真实药物发现中的应用过程。基准数据集包含18个研究充分的靶点，覆盖主要且具有药理学意义的蛋白类别，并经过精心筛选，以尽可能减少与常用训练集之间的重叠。针对每个靶点，整理了关键相互作用信息，并构建了约1000个经过实验验证的活性化合物参考集合。评估主要聚焦于两个核心维度：PLIs与分子合理性。其中，分子合理性的评估进一步扩展至类药性与化学距离等指标。基于该基准与评估框架，系统评估并分析了覆盖三类范式的15种方法，包括4种非3D方法（DeepBlock、DRAGONFLY、SimpleSBDD和TamGen）、8种3D in situ方法（DiffSBDD、Schneuing等人提出的DrugFlow、IPDiff、Lingo3DMol、MolCraft、PocketFlow、SurfGen和TargetDiff），以及5种基于优化的方法（DrugFlow-PA、MolPilot和REINVENT）。其中，DrugFlow-PA与MolPilot分别为DrugFlow与MolCraft的优化版本，而REINVENT则是一种通过强化学习进行优化的非3D模型。最后，提出了一种多层级虚拟筛选工作流程，作为适用于各类靶点感知分子生成方法的后处理协议，用于有效富集具有更优PLIs与更高分子合理性的分子，从而提升其在真实药物发现中的实际应用价值。
2 结果
2.1 靶点感知分子生成的概念框架
为系统分析靶点感知de novo分子生成，首先对训练过程与推理过程进行了形式化定义。这两种互补性定义为评估模型是否真正捕获了靶点-分子关系，还是仅仅依赖表面相关性，提供了基础框架。
定义1（训练范式，Equation 1）：在训练过程中，模型旨在学习靶点-分子对的联合概率分布：
其中，
基于上述定义，进一步提出了猜想1：以靶点感知方式生成的分子应能够编码具有意义的PLIs。这些相互作用既包括显式的物理与化学接触（例如氢键），也包括结合亲和力所反映的隐式性质（例如对接分数）。PLIs还揭示了分子生成中相似性-多样性权衡关系中的一个重要约束：只有在保持形成关键相互作用能力的前提下所产生的多样性，才能被视为具有意义，而这种能力可能是分子活性的潜在前提。这一猜想进一步引出了一个关键问题：尽管3D in situ方法显式整合了空间关系，但其是否能够充分捕获PLIs？相反，非3D范式虽然缺乏显式结构约束，是否仍能够通过学习得到的映射关系隐式重建PLIs？
定义2（推理范式，Equation 2）：在推理阶段，模型通过从化学空间上的条件分布中进行采样来生成分子：
其中，
基于上述定义，进一步提出了猜想2：靶点感知生成模型应能够将其输出限制在化学空间中具有生物学相关性且具备靶点特异性的子空间内。换言之，与特定靶点相关的活性分子通常分布于化学空间中的特定区域，而具有实际意义的生成模型应能够重现这些约束。位于这些区域之外的分子虽然可能表现出较高多样性，但往往缺乏结构合理性或类药性特征。
上述两种定义与猜想共同揭示了评估靶点感知分子生成模型的两个核心维度：PLIs与分子合理性。这两个视角分别对应于经典的基于结构的药物设计与基于配体的药物设计范式，从而为真实药物发现场景中的模型评估提供了自然且稳健的理论基础。
2.2 TarPass基准描述
构建了TarPass基准，其由经过精心整理的数据集与端到端评估工作流程组成。数据集包含按时间划分的靶点结构，每个靶点均配有专家整理的关键相互作用注释以及经过实验验证的参考活性分子。该数据集经过专门设计，以尽可能减少与常用训练集之间的数据泄漏，从而能够在真实药物发现约束条件下评估模型的泛化能力，尤其是在靶点来源于高度可成药蛋白家族的情况下。此外，该基准还支持通过显式量化且具有统计学基础的PLIs与分子性质指标，对生成分子的整体分布进行评估。通过标准化生成分子数量、分子对接协议以及靶点层级聚合报告方式，该框架为不同范式下模型性能的系统表征提供了一个可比较且可扩展的统一测试平台。
靶点结构数据集来源于POKMOL-3D，并经过进一步整理，以避免与CrossDocked2020和PDBbind等常用结构-配体数据集产生直接重叠。具体而言，构建了一个靶点子集，其中所有结构的发布时间均不早于2019年12月，并进一步从两个通常在现有基准中覆盖不足的维度扩展了数据集范围。首先，考虑到在真实药物发现场景中，部分靶点可能仅具有未结合态（apo）的实验结构或计算结构，因此为两个靶点（5-HT2A和BRD4）引入了无配体结构作为对照，以便能够与其结合态（holo）结构进行直接比较。其次，由于变构位点通常未被显式纳入现有基准，因此额外加入了两个变构靶点（MEK1和TYK2），用于评估模型是否能够针对这些非经典结合位点生成分子。最终数据集包含18个靶点对应的20个结构，覆盖激酶、非激酶酶类、G蛋白偶联受体（GPCRs）、核受体以及另外两类蛋白。值得注意的是，数据集中所有靶点均与已获批药物或临床候选药物相关，从而保证了其生物医学相关性以及与真实药物发现约束条件之间的一致性。
为量化潜在数据泄漏程度以及模型泛化所面临的内在挑战，采用MMseqs2与Foldseek，从序列与结构两个层面，将测试靶点与CrossDocked2020及PDBbind中的靶点进行了比较。结果表明，所有测试靶点与这些训练集条目之间的序列一致性均低于1%，说明其在序列层面上的直接重叠非常有限。结构相似性方面，激酶类靶点之间则普遍更高（通常超过10%），这也反映了真实情况：具有较高可成药性的蛋白家族在公共数据集中往往被大量覆盖。因此，该基准被明确设定为用于评估模型在代表性蛋白家族内部的泛化能力，而非依赖于不现实的“全新蛋白家族”靶点进行评估。
对关键保守相互作用进行了整理，以作为具有机制基础的评估目标，其定义基于以下三个严格标准：（1）文献支持的、参与内源性配体识别的保守残基与结合特征；（2）晶体学证据或突变实验支持的相互作用；（3）通过PLIP识别并在多个结构中重复出现的接触模式。这些相互作用主要包括氢键与疏水相互作用，同时还包括盐桥、π-堆积以及卤键。水桥与金属-配体相互作用未被纳入考虑范围。
针对每个靶点，均从BindingDB中收集了经过实验验证的活性化合物，以构建靶点特异性的参考集合。经过t-SNE降维后，这些活性化合物在不同靶点及蛋白家族之间呈现出明显的聚类分布模式，从而支持了此前提出的猜想：与特定靶点对应的活性分子天然受到化学空间中特定区域的约束。与从ChEMBL35数据集中随机选择的分子相比，这些活性化合物在类药化学空间中呈现更广泛分布；而CrossDocked2020中的分子则主要集中于相对较窄的区域，这表明其可能存在覆盖范围偏倚。
此外，还加入了一个由1000个从ChEMBL中随机采样得到的分子组成的基线集合。这些分子的重原子数范围较广（4至54，平均值为28.40），QED值范围为0.04至0.95（平均值为0.56），体现出较高的化学多样性。值得注意的是，由于ChEMBL中的分子本身在很大程度上富集了生物活性信息，因此该随机基线中的两个化合物与特定靶点的参考化合物存在重叠。尽管这一基线并非纯噪声数据，但其能够有效模拟真实场景：即在已知类药化学空间中，通过虚拟筛选识别潜在活性化合物的过程。该基线不仅能够用于评估模型是否相比于从现有化学数据库中的随机采样具有额外价值，还能够补充靶点特异性参考集合之间的比较，并避免对绝对对接分数进行过度解读。
为了保证不同模型之间评估过程的一致性与可比性，构建了一套统一且透明的基准工作流程。针对每个靶点，被评估模型最多运行两轮生成过程，以产生1000个唯一分子，从而在分子多样性与生成效率之间取得平衡。随后，生成分子被输入标准化分子对接模块，该模块尽可能贴近真实药物发现中的常见应用流程。对于3D in situ方法，还额外加入了重新评分阶段，用于评估生成分子的初始构象。由该模块得到的对接分数、结合构象以及相互作用信息，将与生成分子集合一起输入后续评估阶段。整个评估与分析框架由三个核心模块组成：（1）分子合理性评估；（2）PLIs分析；（3）基于前两个模块结果的靶点层级综合分析。所有结果均以标准化格式导出，从而支持不同模型之间的系统比较以及后续元分析。
图2｜ a. 按蛋白家族划分的测试靶点分类饼图。b. 测试靶点与两个常用训练数据集CrossDocked2020（CD2020）和PDBBind之间的序列与结构相似性分析。c. 基于ChEMBL分子作为背景的化学空间t-SNE投影，展示所有参考活性化合物以及CD2020训练集分子的分布情况。
2.3 生成的基础性能
首先，在统一基准框架下评估了多种靶点感知分子生成方法的实际部署能力，重点关注三个关键方面：运行效率、对输入结构的兼容性以及集合层级输出质量。
表 1 | 被评估模型及其基础性能概览
不同范式之间在生成吞吐效率方面存在显著差异。非3D模型（例如TamGen）通常具有较快的生成速度，单个分子的生成时间一般低于0.1 s。相比之下，3D in situ方法明显更慢。具体而言，对于3D in situ模型，基于流的方法（例如MolCraft和PocketFlow）生成单个分子通常需要1–2 s，而扩散模型（例如IPDiff）或自回归模型（例如SurfGen）在本测试条件下往往超过10 s。需要指出的是，所报告时间定义为从代码启动到生成可读取分子文件之间的平均实际运行时间（wall-clock time）。尽管采用了相同硬件环境以尽可能减少模型初始化开销带来的影响，但后处理步骤的贡献仍不可忽略。例如，TargetDiff等模型会对生成结果进行额外后处理优化，从而影响整体运行时间。
随后，进一步评估了各方法是否能够在无需针对模型进行额外适配的情况下，直接处理所提供的结构输入。有两个模型在特定靶点上表现出兼容性问题：SimpleSBDD无法处理HDAC6中的锌离子以及其他金属离子，因为其预定义原子词表中不包含金属原子，这表明其对金属配位环境的支持能力有限。此外，TamGen不接受用户自定义结构，因此无法将AlphaFold预测得到的5-HT2A结构作为输入。
在分子集合层面，进一步评估了各模型是否能够在不同靶点上达到规定生成数量，以及其生成分子的有效性与非重复唯一分子比例。DiffSBDD、SurfGen和DrugFlow-PA仅在一个靶点上未达到所要求的唯一分子数量，而MolPilot则在18个靶点上均未满足该标准。有趣的是，MolPilot获得了1的完美唯一性分数。这与其VLB最优调度策略一致：该方法通过沿“twisted”概率路径进行分阶段采样，并耦合二维拓扑与三维构象，从而减少对高概率二维分子图的重复访问，并有效抑制重复分子的产生。然而，在固定迭代预算条件下，MolPilot有效样本产率较低，因此可能难以达到所要求的分子集合规模。
在有效性方面，除DrugFlow系列之外，其余所有模型均表现出较高有效性。当出现无效输出时，主要来源于化学上不合理的Kekulé结构，这表明生成分子图中的键分配过程仍然是一个关键失效来源。然而，需要指出的是，如前所述，带有后处理步骤的模型可能会主动过滤无效分子，从而人为提高其表观性能。
在唯一性方面，非3D方法始终能够生成高度唯一的分子集合。在3D in situ方法中，除基于流的方法之外，其余模型同样表现出较高唯一性，通常高于0.9。相比之下，DrugFlow和PocketFlow等基于流的方法唯一性通常低于0.7，这表明其在分子图采样策略方面可能存在一定问题。
2.4 蛋白-配体相互作用分析
2.4.1 分子对接性能
分子对接通常被用作评估靶点与分子之间结合亲和力的粗略替代指标。在此，需要将对接分数与相互作用指标理解为标准化计算代理模型的输出，而非实验结合亲和力的直接估计。此外，分子对接中的误差还可能进一步传播至后续靶点层级以及跨模型比较分析中。
在重新对接与重新评分分析中，3D in situ方法在对接分数方面相较于非3D范式表现出明显的平均优势。然而，仅有少数方法相较于随机基线表现出统计学显著提升。需要指出的是，由于ChEMBL本身对生物活性化学空间存在内在偏倚，因此基线性能可能被一定程度高估。尽管如此，这些结果仍表明，对当前靶点感知生成模型而言，对接分数优化仍然是一个具有挑战性的问题。
图3｜ a. 不同模型或方法在Vina Score上的性能与分布（参考活性分子中位数为−9.109，以灰色虚线表示；随机基线中位数为−8.217，以黑色虚线表示）。b. 基于精确匹配率表征的相互作用恢复能力分布（参考活性分子中位数为0.470；随机基线中位数为0.121）。c. 3D in situ模型及其优化版本在不同靶点上的初始构象无碰撞率分布；红色框标示了HDAC6中异常高的空间碰撞数量。d. 生成分子与HDAC6锌指结构域之间的空间位阻碰撞。e. 从不同模型中选取的构象重置对接代表性案例，包括对接后构象、构象比对结果以及相对于初始构象的RMSD。
重新对接结果表明，3D in situ模型在对接分数方面始终优于非3D范式，其中平均中位对接分数范围为−7.5至−10，并在优化后进一步降低至−10以下。然而，与参考分子及随机选取分子的统计比较结果显示，仅有1种非3D模型、1种基于优化的方法以及4种3D in situ模型，在超过50%的靶点上表现出相较随机分子的显著更优对接分数。这意味着许多其他模型的性能甚至可能无法超过随机选择分子。在3D in situ模型中，尽管整体重新对接表现更优，但仅有MolCraft与DrugFlow能够持续优于非3D方法。重新评分结果进一步强化了这一趋势：仅这两个模型获得了低于−7.5的中位分数，而DiffSBDD等表现较差的模型甚至产生了正值分数。
与对接分数不同，大多数模型的配体效率均明显高于随机分子与参考分子，这主要归因于其较低的分子量。考虑到分子量对对接分数存在偏倚影响，这一结果表明，即使Lingo3DMol等模型未获得更优对接分数，其仍在一定程度上捕获了结合口袋，并利用较少原子形成了有利相互作用。然而，这些模型对结合位点空间的利用仍然不足，这表明提升空间利用效率可能是进一步提高模型性能的有效方向。
2.4.2 相互作用恢复能力
除结合亲和力评估之外，准确重现指定关键相互作用的能力，为检验模型靶点感知能力提供了更加严格的标准，同时也揭示了当前生成模型与参考配体之间存在的显著差距。相互作用恢复能力评估主要聚焦于两个关键指标：精确匹配率（Exact Match），用于衡量所有指定相互作用被完整准确重现的比例；以及相对宽松的匹配率（Match Ratio），用于衡量任意单个指定相互作用被成功重现的情况。
参考配体的精确匹配率仅达到51.4%，这主要受限于当前分子对接协议本身的准确性。此外，PLIP所施加的严格几何与距离约束，也可能由于细微坐标偏差而引入额外假阴性结果。尽管如此，该结果仍然超过随机基线（22.3%）的两倍，从而支持了基于关键相互作用评估模型的合理性。在重新对接条件下，大多数模型的表现并未优于随机分子。较为突出的例外包括DrugFlow、MolCraft及其优化版本，其表现已接近参考配体水平。引入显式相互作用先验的模型则表现出明显差异：IPDiff甚至低于随机基线，而Lingo3DMol则优于部分3D in situ方法，这表明相互作用先验的设计方式对于模型有效性具有决定性影响。REINVENT的表现则下降至随机基线以下，这很可能是由于其强化学习过程仅将亲和力作为奖励目标所导致。
总体而言，相较于获得较优结合亲和力，准确重现关键分子相互作用更加困难，仅有少数模型能够接近参考配体的性能水平。尽管分子对接精度以及PLIP可能引入的假阴性结果会导致恢复率被低估，但整体相对趋势依然保持一致，并支持上述结论。无论是在对接分数还是相互作用指标方面，3D in situ范式相较于非3D范式均表现出略优的平均性能，其中DrugFlow与MolCraft尤为突出。然而，这两个模型需要额外的配体输入以及大规模采样过程。为进一步分析这一现象，进行了额外测试，结果表明，这两种模型的优异表现可能与原始输入配体高度相关。这也使得其稳健性与泛化能力受到质疑。
2.4.3 初始构象与对接姿态
姿态层级分析表明，空间位阻合理性与结合模式保真性仍然是多数模型面临的重要限制：3D in situ方法生成的初始构象通常存在空间碰撞，而仅有少数模型能够达到接近参考配体的结合模式相似性以及亚埃级（sub-ångström）质心精度，这也与其在相互作用与亲和力指标上的较优表现一致。
采用PoseBusters中的标准对空间碰撞的评估结果显示，大多数3D in situ模型生成的初始姿态均存在一定比例的空间碰撞。除IPDiff之外，没有任何方法的无碰撞率超过85%。基于优化的方法则表现出一定改进：DrugFlow-PA与MolPilot相较于各自基础模型，其无碰撞率分别提高约13%与约8%，且两者均超过90%。
结构分析进一步揭示了导致空间位阻冲突的靶点特异性因素。对于5-HT2A_AF与HDAC6，近一半模型的无碰撞率低于0.5。在5-HT2A_AF中，主要问题来源于TargetDiff等模型，其使用的是一个不完整的口袋，并设置了10 Å截断只，从而导致生成构象在完整结合口袋中与ECL2区域发生碰撞。对于HDAC6而言，空间碰撞主要来源于锌指结构域，大多数模型要么忽略了锌离子，要么未能正确捕获锌-配体配位关系。例如，DiffSBDD生成的构象中，与锌离子最近的原子为距离仅1.5 Å的碳原子，这与金属配位需求并不相容。类似地，MolPilot生成了距离锌离子1.7 Å的氧原子，这两个距离均短于晶体结构中常见的Zn-O键长（通常大于2 Å）。
结合模式相似性分析进一步揭示了系统性趋势。以靶点结构中的共晶配体作为参考，计算了SuCOS指标，该指标结合了对接姿态的形状重叠与化学特征重叠，并进一步拆分为形状相似性与静电相似性（ESP-Sim）。参考配体在所有指标上均持续优于随机基线，从而验证了其合理性。总体来看，结合模式相似性的变化趋势与亲和力及相互作用分析结果基本一致：非3D模型以及部分3D in situ模型（例如IPDiff与PocketFlow）的表现接近随机基线，而DrugFlow与MolCraft则获得了接近参考配体的相似性结果，这表明仅有少数模型能够稳定重现类天然结合模式。在各相似性组成部分中，形状相似性在不同模型之间的差异最大，其范围从TamGen的0.268到DrugFlow-PA的0.523；相比之下，静电相似性则相对稳定，基本维持在0.50–0.59范围内。这说明结合模式相似性的差异主要来源于形状特征。
为进一步量化生成姿态的准确性，计算了生成姿态与原始配体之间的质心位移。非3D模型表现出明显更大的位移。相比之下，DrugFlow与MolCraft在初始构象中的质心位移均达到≤1 Å，甚至低于参考配体。值得注意的是，对接后质心位移与Exact Match相互作用指标之间呈现负相关关系（
2.4.4 3D in situ范式中的初始姿态探索
基于一系列与分子对接相关结果的分析，可以观察到重新对接通常能够提高3D in situ模型的无碰撞率与对接分数。此外，初始姿态较强的重新评分性能是成功重新对接的重要前提，这进一步强化了此前对于3D in situ框架构象可靠性的担忧。然而，相较于同时作为采样中心的共晶配体，重新对接后构象的质心明显偏离初始构象。这种位移会导致相互作用匹配率与结合模式相似性下降，表明当前初始姿态预测在空间精度方面仍然存在明显不足，其原因可能来自空间位阻冲突，或模型无法捕获能量最优构象。这一现象进一步引出了一个新的问题：如果忽略这些次优初始姿态，并在分子对接前完全重置配体构象，是否能够作为一种更加精确的活性化合物评估策略？
为验证这一假设，选取了一部分性能不同的3D in situ模型进行了构象重置对接分析。与重新对接相比，构象重置对接额外引入了一个预处理步骤，即舍弃原始初始构象，并使用经过MMFF94优化后的构象进行替换。由于3D in situ模型倾向于在预定义区域内生成分子，尤其是在关键残基周围，因此构象重置对接能够提供一种具有价值的补充性评估方式。在配体初始构象及其预测姿态均不理想的情况下，该过程有助于摆脱标准重新对接难以克服的局部极小值状态，从而为这一范式下模型的评估提供更加稳健的方法。
对于所有测试模型而言，相较于基于初始构象进行的重新对接，构象重置对接均产生了更低的结合亲和力、相互作用匹配率以及结合模式相似性。尽管如此，这些模型之间的相对性能排序整体仍保持一致，其中DrugFlow、Lingo3DMol与MolCraft依然持续优于非3D基线方法。随后进一步比较了两种对接流程下的姿态位移情况。总体而言，能够生成更合理初始构象的模型，在重新对接后通常具有更低的坐标均方根偏差（RMSD）与构象比对RMSD，其中中位值通常低于2.5 Å；而初始构象较差的模型，其中位RMSD则往往超过5 Å。在构象重置对接后，所有模型的坐标RMSD均出现不同程度增加，这与此前观察到的姿态中心位移趋势一致。进一步选取了若干案例用于展示构象重置对接的影响：尽管这些模型生成的初始姿态合理性存在差异，但在构象重置对接后均表现出明显位移。虽然重新对接后的姿态具有较低的构象比对RMSD，并在一定程度上修正了原始位置，但后续构象重置对接则进一步将这些姿态从原始位置推离，并引导其进入在结构与能量层面更合理的区域。例如，在DrugFlow中，稠环体系移动至一个更宽广的空腔区域，而仅伴随较小的对接分数损失；与此同时，PocketFlow中的分子在构象重置对接后，其对接分数反而得到提升。
总体而言，这些结果表明，构象重置对接通过将配体放置过程与初始构象偏倚影响相分离，提供了一种补充性且与模型无关的评估方式。尽管在构象重置后绝对性能指标出现下降，但模型之间相对排序的一致性说明其相对性能仍具有较好稳健性。系统性的质心位移、相互作用恢复能力下降以及RMSD增加，共同表明当前3D in situ框架仍然受到初始姿态预测精度的明显限制。而采用重置配体构象的评估协议，则能够更加有效地揭示模型在靶点识别以及合理结合模式生成能力方面的真实差异。
2.5 合理性、类药性与化学距离分析
2.5.1 分子合理性
分子合理性主要在二维结构层面进行评估。在此，参考分子与随机分子被统称为“真实化合物（real compounds）”，因为生成模型虽然能够生成理论上有效的分子，但这些分子未必在实际中具有可行性。
在基础结构性质方面，部分基于图的3D in situ模型（例如DrugFlow与IPDiff）表现出结构不完整性，其原因可能来自生成了不连通分子图。立体化学特征也与真实化合物存在明显差异：真实化合物平均通常含有少于1个手性中心以及约0.03个螺环原子。非3D模型基本能够重现这一趋势，而3D in situ范式中的扩散模型则生成了过量立体化学特征（超过3.5个手性中心以及0.08个以上螺环原子），从而明显削弱了分子合理性。在分子柔性方面，大多数模型生成的分子平均具有4–7个扭转角，可旋转键比例介于0.2–0.3之间，与真实化合物特征较为一致。然而，SurfGen与IPDiff生成的分子柔性较低，这可能与其偏向生成刚性多环骨架有关。此外，还评估了对分子相互作用具有关键作用的杂原子比例。IPDiff与PocketFlow生成分子的杂原子比例低于0.2，低于真实分子以及大多数其他模型，表明其杂原子表示不足，而这可能进一步削弱生成分子的类药性。
在环相关性质方面，大多数模型生成的分子平均包含3–5个环，其分布与真实化合物较为接近。考虑到环系在类药分子中的关键作用，进一步量化了无环分子的比例。参考配体中的无环分子比例几乎可以忽略（0.035%），而所有其他模型均表现出明显更高的比例，其范围约为随机分子的2–8倍，最高达到6.4%。对于芳香环而言，参考集合平均每个分子含有3.226个芳香环，而多数模型生成的分子芳香环数量低于3，一些方法（例如IPDiff）甚至平均不足1个。
过于复杂或不稳定的环结构可能带来显著合成困难，甚至无法在真实条件下存在。在此，将三元环以及八元及以上大环定义为“不理想环结构（undesired rings）”。尽管这些结构通常属于有效结构基元，并且在参考化合物中的出现频率达到15.8%，但大多数模型生成此类结构的比例明显更低，其中非3D模型平均低于10%。相比之下，DiffSBDD生成分子中有42%包含不理想环结构。对于稠环体系而言，大多数模型平均每个分子生成0.5–0.8个稠环体系，与真实化合物中的分布较为一致。非3D模型略低，平均约为0.5。双环稠合体系是药物中的重要药效团，但包含三个及以上稠合环的体系会显著增加分子刚性与合成难度，因此被定义为“高度稠合（highly fused）”结构。非3D模型生成的高度稠合环数量通常少于真实分子，而大多数3D in situ模型则表现出明显更高的频率，多数超过25%。其中，SurfGen尤为极端，其74%的生成分子均包含高度稠合体系。
总体而言，包括所有非3D模型以及Lingo3DMol与PocketFlow在内的预训练模型，表现出避免生成过量立体化学特征或过于复杂环体系的倾向。其生成分子在柔性与复杂性方面更接近真实化合物，因此具有更好的分子合理性。相比之下，其他基于图的3D in situ模型则倾向于生成不合理或难以合成的骨架结构，这很可能反映出其训练过程中对化学空间覆盖范围有限。
2.5.2 类药性
在结构分析基础上，进一步评估了类药性指标与结构警示（structural alerts）。对于QED指标而言，非3D模型整体表现优于其他模型，多数得分高于0.6，而大多数其他模型则介于0.45–0.6之间。参考化合物的平均QED值为0.474，仅有少数模型略低于这一水平。在经典经验规则Lipinski“五规则”符合度方面，除基于优化的方法DrugFlow-PA与REINVENT之外，几乎所有模型均达到约3.9项规则通过，与真实化合物表现相当。合成可及性（SA Score）评估则显示出更明显差异。基于序列的方法，无论属于何种范式，其得分均接近或低于参考分子的平均值3；相比之下，除PocketFlow之外，大多数基于图的3D in situ模型均超过3.5，其中SurfGen与DiffSBDD甚至超过4。针对性优化则展现出明显效果：DrugFlow-PA相较于其基础模型，将合成可及性提高了0.9。
结构警示分析进一步揭示了不同模型之间的差异。PAINS过滤规则匹配结果在各模型之间差异较小，并与参考化合物水平基本接近。相比之下，用于识别不良药物化学基团的 SureChEMBL alerts，在多数3D in situ模型中明显更高（约0.3次命中，较参考化合物高约50%）；而除SimpleSBDD之外，所有非3D模型均优于真实化合物。DrugFlow-PA再次表现出明显优化效果，其SureChEMBL命中次数相较基础模型降低超过三倍。对于 Glaxo alerts 而言，除REINVENT之外，其余所有模型均劣于参考化合物。不过，大多数模型与随机分子的表现较为接近，其中DiffSBDD表现最为异常。
总体而言，预训练模型通常能够获得更优的类药性与合成可行性，但基于图的3D in situ模型仍容易生成不理想结构基元。值得注意的是，以性质为导向的优化能够在一定程度上缓解这些缺陷，从而体现出其作为预训练补充策略、提升生成分子整体质量与实际应用价值的重要作用。
2.5.3 化学距离
为进一步评估靶点内部的配体层级行为，重新回到猜想2，即从化学空间距离角度对模型进行评估。为此，计算了两个多样性指标以表征靶点内部多样性。对于内部多样性（IntDiv）而言，各模型之间差异较小，其数值范围为0.85–0.9，与随机分子较为接近，但高于活性化合物（0.798）。相比之下，#Circle指标具有更强区分能力：参考化合物的得分为75，而随机分子达到517。大多数模型得分均超过100，其中DiffSBDD与MolCraft甚至超过随机基线。这些结果表明，许多模型生成的分子集合在化学空间中过于分散，这不仅增加了构建靶点导向分子库所需的计算负担，也进一步提高了后续筛选验证成本。
随后，进一步比较了生成分子与参考分子及随机分子之间的化学距离，并采用了两类距离度量方式：基于嵌入的距离与基于描述符的距离。前者包括基于ECFP4指纹计算得到的Tanimoto相似性，以及来源于深度学习嵌入的Fréchet ChemNet Distance（FCD）。该研究提出的基于描述符的距离，则定义为15种在参考分子与随机分子之间表现出显著差异的理化与结构描述符上的平均Wasserstein距离：
其中，
由于参考分子与随机分子均来源于与生物活性相关的化学空间，因此设计了一种偏移指数，用于量化生成分子偏离类药化学空间的程度，并利用Fréchet距离与Wasserstein距离所满足的三角不等式性质进行定义。之所以采用基于三角不等式的偏移量，而不是分别报告“到参考集合距离”与“到随机集合距离”，是因为后者需要同时解释两个具有尺度依赖性的量。偏移指数则能够将生成集合、参考集合与随机集合之间的相对几何关系压缩为单一归一化数值，从而使不同靶点之间以及不同距离指标之间的比较更加直接，并降低对基线尺度差异的敏感性。此外，在相似性-多样性权衡关系中，保持与类药化学空间的接近性，对于上述两类用于描述分子性质的指标而言至关重要。相比之下，用于描述结构特征的Tanimoto相似性则可以更加灵活地处理，以支持更广泛的化学空间探索并增强分子多样性。偏移指数定义如下：
其中，
图4｜ a. 以JAK2为例，基于ECFP4指纹的t-SNE投影用于展示随机分子与参考活性分子相对于两种模型生成分子的化学距离关系，其中IPDiff代表表现较差的模型，DRAGONFLY代表表现较优的模型；ChEMBL化合物作为类药化学空间的背景表示。虚线区域表示通过Gaussian KDE计算得到的概率密度轮廓。b. 基于(a)进一步抽象得到的相对偏移指标（O），利用Fréchet距离与Wasserstein距离的三角不等式性质，以及高维距离几何中共享边的优势进行构建。示意图中标记为OA与OB的虚线箭头仅用于概念说明，并不代表真实数值大小. c. 所选模型在不同描述符上的贡献热图。d. 基于FCD与Tanimoto相似性两个维度绘制的跨靶点相似性分布。
为便于理解，需要指出的是：当偏移值接近1时，说明生成分子大致仍位于与随机ChEMBL基线相同的类药化学空间中；更小的偏移值则表示其与参考活性分子更加接近。相反，偏移值越大，则表明生成分布同时偏离参考活性分子与基线类药化学空间的程度越明显。
在基于嵌入的距离指标中，Tanimoto相似性表现出有限区分能力，非3D模型与优化方法仅获得略高的数值。相比之下，FCD则揭示出更明显差异：几乎所有模型的表现均劣于随机分子，其中预训练模型主要集中在约30附近，而其他模型则接近40。对应的FCD偏移量也呈现出相同趋势：预训练模型通常保持在2.5以下，而容易生成不理想结构的模型则超过3，这表明其逐渐偏离类药化学空间。基于优化的方法同样表现出较高偏移量，说明针对单一性质进行优化可能会使生成分子远离类药化学空间。值得注意的是，两种基于ChEMBL预训练的模型获得了最低偏移量（1.3–1.4），反映出其生成分子与真实化合物之间具有较高接近性。
表2｜内部多样性以及基于嵌入与描述符距离指标的性能表现
基于描述符的距离指标则提供了具有互补性且更易解释的结果。参考分子的Wasserstein距离（Wass. Ref）与FCD之间表现出显著相关性（ρ = 0.58，p = 0.02），从而验证了其作为相似性度量指标的有效性。与FCD类似，大多数模型的表现均劣于随机分子，但基于ChEMBL预训练的模型始终位于表现最佳的方法之列。Wasserstein偏移指标对于异常值更加敏感，因此能够放大特定描述符上的偏离现象。例如，REINVENT在clogP方面表现出明显偏移（平均值为6.59），这与其偏向生成富含杂原子的分子相一致；而DrugFlow-PA则在氢键受体数量、杂原子数量以及TPSA方面表现出明显偏离，这进一步揭示了性质导向优化可能带来的潜在风险。
最后，还分析了针对不同靶点生成的分子是否占据彼此不同的化学空间，因为这通常是靶点特异性化合物应具备的特征。跨靶点比较结果表明，没有任何模型在跨靶点相似性方面超过参考分子。大多数非3D模型在FCD与Tanimoto相似性两个指标上均表现较差，其聚类主要集中于右下象限，这表明其可能存在过拟合现象。与CrossDocked2020训练集之间的Tanimoto相似性分析也进一步支持了这一趋势，其中经过预训练的非3D方法表现出明显更高的相似性。相比之下，3D in situ模型由于具有更高结构多样性，因此表现出较低Tanimoto相似性，但同时具有较高FCD值，这表明其在与生物活性相关特征上的多样性仍不理想。
2.6 靶点特异性的初步探索
根据猜想2，靶点感知分子生成应受到各靶点特定条件的约束，这意味着针对不同靶点生成的分子应表现出可辨别的差异，即靶点特异性。各模型在不同靶点之间生成分子的相似性模式已进行了初步评估。而靶点本身，对不同靶点之间是否能够产生特异性还需进行初步探索。
2.6.1 蛋白家族视角下的特异性
为探索不同蛋白靶点之间的分子相似性，首先计算了所有靶点之间的两两FCD。由于非3D模型存在潜在过拟合倾向，因此分别针对非3D范式与3D in situ范式进行了独立计算。总体来看，非3D模型的跨靶点FCD明显低于3D in situ模型，而两者又均低于参考分子。在两类生成范式中，激酶与GPCR家族始终表现出较低的家族内部FCD差异，说明同一家族内部生成分子的相似性更高。这一现象可能源于这些蛋白家族本身具有较高保守性以及相似结构特征，这表明模型在一定程度上能够捕获并整合靶点特异性的结构信息，从而指导分子生成。其他蛋白家族同样从侧面支持了这一结论。例如，RXR-alpha与大多数其他靶点之间通常表现出较高FCD，但与其同家族成员PPAR-alpha之间则具有更低FCD。相比之下，非激酶酶家族由于在结构与功能上更加多样，因此无论家族内部还是家族之间，其差异均相对较小。
为从PLIs角度评估靶点特异性，采用对接分数与相互作用匹配率作为评估指标。针对所有生成分子，以模型与靶点作为因素进行了双因素方差分析。结果显示，模型与靶点均存在显著主效应，同时还存在显著交互效应，这表明两者会共同影响分子表现。基于这些统计结果，进一步进行了事后检验，以比较不同靶点之间的性能差异。显著性热图结果表明，无论是在重新对接还是重新评分条件下，同一蛋白家族内部的对接分数与匹配率均未表现出显著差异。这说明模型在同一家族内部不同靶点上的平均表现较为接近，也意味着家族内部异质性相对有限。尽管这两个指标均会受到靶点本身固有特征的影响，但结果仍表明模型在不同类型靶点之间存在性能差异。总体而言，这些结果说明当前靶点感知分子生成在蛋白家族层面已经表现出一定程度的靶点特异性。
2.6.2 相似结构中的一致性与特异性
从TarPass集合中进一步整理构建了一套一致性-特异性测试集，其中包含两类蛋白配对。第一类为5-HT2A与BRD4的apo-holo配对，其RMSD分别为0.402 Å与0.304 Å，用作结构匹配靶点，以评估生成一致性。第二类为位点特异性的JAK2-TYK2配对，其RMSD为1.657 Å。二者均属于JAK家族，但其结合口袋存在明显差异（ATP结合口袋与假激酶结构域），因此能够用于评估在存在显著模体层级差异条件下的靶点特异性。
采用FCD量化分子相似性。对于5-HT2A apo配对，大多数模型均表现出较低FCD，通常介于1–4之间。然而，对于BRD4，则有更多模型表现出高于平均水平的FCD。相比之下，对于位点特异性的JAK2-TYK2配对，没有任何模型能够相对于对应参考配体表现出预期的靶点特异性（约18.6）。理想情况下，apo配对的FCD应低于位点特异性配对，以分别反映结构一致性与靶点特异性。总体来看，仅有DeepBlock、DrugFlow与PocketFlow符合这一预期模式，但需要指出的是，DrugFlow依赖于原始配体采样。大多数非3D模型的FCD主要聚集于跨靶点平均值附近，而部分3D in situ模型（例如DiffSBDD与IPDiff）甚至表现出相反趋势。
针对表现差异明显的模型进一步进行了交叉对接分析，从PLIs层面揭示了这些差异。非3D模型无论对于apo配对还是位点特异性配对，通常都难以产生显著区别。其中，DRAGONFLY表现出明显过拟合，而DeepBlock则在JAK2-TYK2配对中捕获到了有限的PLI差异，这说明其仍保留了一定程度的靶点特异性区分能力。相比之下，3D in situ模型则表现出更加明显的异质性行为。对于5-HT2A，其结果相对一致；而在BRD4 apo-holo配对中，则表现出明显变化。对于JAK2-TYK2，大多数模型在多个PLI相关指标上均表现出对原始靶点更明显的偏向性差异。
基于对PLIs的观察结果，分析了特定分子之间的差异是否能够体现为其对接姿态质心偏移。结果表明，非3D模型在所有蛋白配对中均表现出较小的质心位移，这与其较小的PLI差异一致。对于3D in situ模型，则观察到模型性能可能与配体质心相对于关键残基的相对位移有关。具体而言，在BRD4-apo与TYK2中，来源于非原生蛋白的分子，其质心相对于核心残基发生了偏移，同时其PLI表现也劣于来源于原生蛋白的分子。此外，尽管通过结构比对为BRD4-apo选择的采样中心仍位于结合口袋内部，但其已偏离Lys140这一形成关键氢键的重要残基。考虑到部分3D in situ模型仅考虑距离采样中心10 Å范围内的口袋环境，这种偏移可能说明这些模型对局部口袋环境过于敏感，因此在holo-apo比较中缺乏足够稳健性。结合多种化学距离指标中观察到的不规则模式，这些结果表明，3D in situ模型在对结构相似蛋白进行敏感且准确区分方面仍存在困难。这些模型生成的分子在结构相似性方面表现出不一致趋势，在PLI评估中表现出明显基于质心的位置偏移，并且如前所示，其PLI行为仍存在较大随机性且整体表现不理想。
总体而言，鉴于非3D模型通常表现出较弱靶点特异性，目前3D in situ模型是否真正具备细粒度、真实靶点特异性的生成能力，仍需进一步验证，并有必要开展更加全面与系统的评估，因为当前分析仍然建立在有限且研究较多的蛋白家族基础之上。
图5｜ a. 一致性-特异性测试集中蛋白配对的构象比对结果与RMSD。b-c. 交叉对接后，针对原生靶点生成的分子与针对配对靶点生成的分子之间，在对接分数（Score）与SuCOS上的差异显著性热图；仅当差异具有统计学显著性时对应单元格才进行着色。d-f. 交叉对接后，对接分数、SuCOS以及完全匹配相互作用恢复率之间的差异；蓝色方向表示理想变化方向。g-i. 针对原生蛋白生成的分子与针对配对蛋白生成的分子之间，在多种分子相似性指标上的差异热图；颜色越深表示化学差异越大。j-k. 交叉对接后，平均配体质心相对于关键残基的位置偏移；灰色圆圈表示对接网格中心。
2.7 基于多阶段虚拟筛选后处理提升模型可用性
尽管在PLIs与分子合理性方面仍存在局限性，但仍进一步探索了是否能够利用表现较优模型在分子多样性方面的优势，以富集新型活性化合物集合。为此，借鉴已有相关工作，构建了一套多层级虚拟筛选工作流程，并将其作为后处理策略，通过硬约束优先筛选在PLIs与分子合理性方面表现较优的分子。该策略旨在提升生成模型在真实药物发现场景中的实际可用性，并在一定程度上基于筛选结果实现对不同模型性能差异的比较评估。
第一阶段基于PLIs、结构合理性以及类药性实施硬过滤，这些规则通过TarPass基准分析结果实现自动化与定制化。随后阶段则进一步采用更加精细的筛选技术，例如经验性软过滤或聚类分析，以将候选分子缩减至可管理且可验证的规模。作为测试案例，选择了JAK2与TYK2用于评估该流程。
在第一阶段中，采用了较为宽泛且保守的筛选标准，以模拟靶点表征信息不足情况下的真实应用挑战。对于JAK2而言，对三类筛选标准独立通过率的分析表明，仅有3D in situ模型及其优化版本在PLI层面实现了超过40%的通过率；相比之下，非3D模型在PLI方面表现略弱，但在结构可行性与类药性方面仍保持优势，这与此前评估结果一致。对表现较优模型生成的分子进行顺序过滤后的结果表明，大多数分子被淘汰的主要原因是关键相互作用不匹配，或未达到SA Score与QED阈值。这表明这些性质已经成为当前模型输出中的主要瓶颈，同时也是未来模型改进中需要重点优化的方向。当然，由于分子对接精度限制以及缺乏类药性优化，许多参考化合物同样在这两个阶段中被过滤掉。
图6｜ a. 不同模型在三类评估标准下的通过率，其中圆圈大小表示总体相对通过率。b. 顺序过滤过程中剩余分子数量的变化趋势。c. 经缩减至适当范围后的分子MM/GBSA结合自由能ΔG与Tc
在三个维度上完成第一阶段硬过滤后，3D in situ范式与非3D范式均保留了约10%的分子，这表明两类范式在真实药物发现场景中均具有一定实际应用潜力。然而，剩余分子数量仍然过大，难以直接进行实验验证。为解决这一问题，进一步选择了两个表现较优的代表模型——MolCraft（3D in situ）与DeepBlock（非3D）——进行后续精细筛选。尽管基于二维相似性的聚类通常是虚拟筛选或分子生成中常用的分子库缩减策略，但由于所选模型具有较高内部多样性，因此聚类方法在该研究中效果有限。因此，进一步采用基于经验的软过滤策略，以将候选分子数量进一步缩减至20–30个的可管理规模。
在这一进一步缩减后的规模下，通过计算来源于参考分子的回顾性指标，对模型的富集能力进行了评估。结合自由能采用分子力学/广义Born表面积（MM/GBSA）方法计算，并以原始配体作为参考。分子相似性则通过相对于参考配体的Tc
总体而言，这种将粗粒度与精细化筛选相结合的多层级虚拟筛选策略，作为当前靶点感知分子生成模型的后处理方法，展现出了较有前景的富集效果。第一阶段通过结合基于PLIs、结构合理性以及类药性的硬过滤规则，将候选分子规模缩减至原始数量的约10%。随后，进一步的精细化筛选又将候选集合缩减至适合实验验证的可管理规模。尽管硬过滤阶段优先保证PLI有效性与分子合理性，而相对牺牲了部分多样性（例如限制骨架新颖性），但这种权衡可以通过后续软过滤阶段采用更加灵活的筛选标准得到一定程度缓解。
根据具体靶点特征以及生成模型本身性能，这种后续优化过程还可以灵活结合经验性软过滤、聚类分析或分子动力学模拟，从而实现更高效的候选分子富集，并促进后续实验验证中的候选化合物优先级排序。然而，多阶段筛选只能作为从“生成”走向“发现”过程中的必要但仍不充分的桥梁。这也进一步表明，未来真正的改进仍需要来自姿态预测精度、相互作用保真性以及分子合理性的提升，而不能仅仅依赖于后处理筛选策略。
3 讨论
随着生成模型的快速发展，基于深度学习的靶点感知de novo分子生成器逐渐成为药物发现中新型化学空间探索的重要工具。然而，这类模型往往难以真正捕获靶点-配体关系的本质。此外，训练数据集对化学空间覆盖范围有限，也进一步限制了生成分子的保真性，并最终制约其在真实药物发现中的实际应用能力。为评估此类模型的真实能力，提出了TarPass基准，对三类经典范式下的15种模型进行了系统评估。基于研究充分的靶点，从三个关键维度对模型性能进行了分析：PLIs、结构合理性以及类药性。通过设计标准化下游评估协议，尽可能提高了不同模型之间比较的公平性；然而，由于训练数据、模型能力以及输入要求之间本身存在差异，因此此类评估仍无法完全消除这些内在不一致性。
准确建模PLIs是靶点感知分子生成最核心的要求。通过对多个维度的分析，重新回到猜想1所引出的核心问题：尽管3D in situ模型显式整合了空间关系，并且在预测亲和力方面相较于非3D模型具有一定优势，但其中许多模型在结合亲和力与相互作用恢复能力方面均未能显著优于随机分子。此外，其性能还进一步受到初始构象质量较差以及姿态预测不准确的影响。另一方面，非3D模型则难以通过隐式学习靶点-配体关系来重建PLIs，即便直接针对亲和力进行优化，也无法保证正确的相互作用匹配。类似DrugFlow这类基于原始配体采样的方法，虽然能够提高PLI恢复能力，但这种效果仅局限于具有较优参考配体的靶点，因此其更广泛应用能力仍然受到限制。
在结构合理性与类药性方面，以序列模型为主的非3D范式表现更优。这主要归因于其更容易利用大规模类药分子进行预训练，从而能够生成具有更好类药性、更高合成可及性以及更少结构警示的分子。类似地，基于图的模型与3D in situ模型在这一方面同样能够从预训练中获益。相比之下，缺乏预训练的模型则更容易生成不理想结构，例如含有过量立体中心或复杂环体系的分子，这进一步阻碍了其在真实场景中的可获得性与实验验证。3D in situ模型中的性质导向优化能够在一定程度上缓解单一属性上的缺陷；然而，由于分子设计本质上属于多目标优化问题，因此这种优化通常会以其他性质性能下降为代价。化学距离分析进一步支持了这些观察结果：经过预训练的模型能够生成更加接近参考配体以及类药化学空间的分子，并且这些分子在结构与性质特征方面与真实化合物之间的偏差更小。
在靶点特异性方面，尽管这些模型在蛋白家族层面能够表现出一定特异性，但其在准确识别高度相似结合位点之间细微结构差异方面仍面临明显挑战。综合这些结果，可以重新审视猜想2：当前模型仍然难以仅依赖靶点信息，将生成分子有效引导至具有生物学相关性且具备真正靶点特异性的化学空间区域。
总体而言，当前靶点感知 de novo 分子生成模型距离理想化设计目标仍有较大差距。然而，这些模型生成的分子仍然具有一定实际应用价值。为应对这些局限性，构建了一套虚拟筛选工作流程，作为后处理步骤：首先通过基于PLIs、结构合理性以及类药性的硬过滤规则，大规模剔除不理想分子；随后再通过经验性精细筛选实现有效富集，并支持后续进一步验证。该流程能够以较低成本，在真实药物发现场景中部署当前生成模型时，过滤掉大多数不理想分子，识别具有潜在价值的候选命中化合物，从而提高模型整体可用性。
在实验验证结果中，TamGen与PocketFlow等模型倾向于生成尺寸较小、易于合成且容易获得的分子。然而，这类方法在PLIs方面通常表现有限，往往需要从数万个候选分子中筛选，才能获得仅具有微摩尔级活性的化合物。这一现象表明，这些模型本质上更接近于随机分子生成器，而并非真正意义上的理性设计工具。因此，在这种条件下宣称模型具有优越性，很容易陷入Texas Sharpshooter fallacy。此外，当前建模范式仍存在明显局限性，包括预训练模型中的过拟合问题，以及3D in situ模型在结合口袋感知方面的稳健性不足。对于更加严格的应用场景，还需要进一步关注金属离子、保守水分子以及其他辅因子的显式处理。在多样性-相似性权衡关系中，只有当生成分子在PLI行为以及关键分子性质方面已经与已知活性分子保持一致，并表现出合理靶点结合潜力时，结构多样化才具有真正意义。单纯追求新颖性而不保证这种一致性，并不可取。因此，为实现更加精准且有效的分子生成，未来方法需要引入更多先验信息，例如具有明确物理意义的相互作用模式，以更好捕获PLIs背后的生物物理本质；同时还需要结合预训练，以扩展对化学空间的覆盖范围。