Nat. Protoc. 2025 | 用于快速且精确比较蛋白质和核酸结构的US-align图形界面与命令行协议

今天介绍的这项工作来自 Nature Protocols 。该研究围绕结构生物信息学中一个核心问题展开，即如何在蛋白质与核酸等生物大分子之间实现快速且准确的三维结构比较。随着深度学习结构预测方法的快速发展，大量高质量结构模型不断涌现，使得结构比对从单一任务转变为高通量、跨分子类型的基础分析工具。在这一背景下，传统方法因针对特定分子类型或特定任务设计，逐渐难以满足统一分析与规模化应用的需求。该文提出的US-align方法通过引入统一的评分函数TM-score，并结合迭代结构叠合与动态规划策略，将蛋白质、RNA和DNA的多种结构比对任务整合到同一框架中。该方法不仅支持单体、复合物以及多结构比对，还能够处理非顺序对齐等复杂情形，从而实现跨分子类型的结构比较。这种统一性对于功能注释、模板建模以及分子模拟研究具有重要意义。在性能方面，US-align在保持高精度的同时显著提升了计算效率，能够在极短时间内完成结构比对，适用于大规模数据分析。同时，方法提供了命令行工具、在线服务以及与分子可视化软件的集成接口，使其在不同使用场景下均具有良好的可操作性。总体来看，该工作不仅提出了一种高效实用的结构比对工具，也为不同类型生物大分子之间的统一分析提供了方法学基础，对结构生物学与计算生物学研究具有重要参考价值。

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0 摘要

随着结构生物学的发展以及基于深度学习的结构预测技术不断进步，大分子结构之间的快速且准确比较在结构生物信息学中变得愈发重要。US-align是一种高效、通用且开源的程序，可用于蛋白质、RNA和DNA的顺序与非顺序结构比对，支持成对比对和多结构比对，并适用于单体以及多聚复合物结构。US-align的核心算法建立在高度优化的迭代结构叠合与动态规划比对过程之上，并由统一且与序列长度无关的评分函数TM-score进行指导。这种独特的设计不仅保证了其在精度和速度上优于其他针对特定比对任务开发的先进方法，同时也使其成为能够统一处理多种结构比对任务的工具，并支持不同分子类型之间的结构比较。这一点对于基于模板的异源分子结构预测以及功能注释具有关键意义。该文中进一步介绍了US-align的安装及其高效使用方式，包括作为命令行工具、在线Web服务器以及集成于常用分子可视化软件（如PyMOL）的插件形式。US-align的安装通常仅需数分钟，而实际的结构比对过程通常可在1秒内完成。

1 引言

1.1 协议的发展

分子层面的结构比较，包括结构叠合与结构比对，是结构生物学和生物信息学中的基础问题。其中，结构叠合通常是在已知序列对应关系（即残基级对应关系）的前提下，通过优化TM-score或r.m.s.d.等指标，实现两个结构的最优空间重合；而结构比对则需要在叠合之前确定最佳的残基对应关系，例如TM-align和Dali等方法所执行的过程。传统上，不同的结构比对工具通常针对特定分子类型（如蛋白质、DNA或RNA）以及不同的比对任务分别开发，包括单体结构的成对比对、寡聚复合物的比对以及涉及三个或更多结构的多结构比对。这种针对性设计虽然在特定场景下有效，但在实际应用中需要切换不同工具与评价指标，不仅增加了使用复杂性，更重要的是在不同分子类型之间进行结构比较时容易产生歧义，从而限制了异源分子结构比较及功能推断的能力。为了解决这些问题，US-align算法被提出（图1），用以在统一的评分函数TM-score框架下整合上述各类结构比对任务。该评分函数在统计意义上与序列长度无关，使得不同分子类型之间的比较更加一致。最初，US-align主要用于顺序结构比对，随后进一步扩展，引入了非顺序结构比对功能，从而能够处理更复杂的结构关系。总体而言该方法构建了一个通用框架，可用于生物大分子结构的比较与评分。

图1｜US-align算法及其不同对齐模式示意图。 a，US-align用于不同对齐任务的核心迭代“结构叠合-比对”算法。其中，“结构叠合”指通过对一个结构进行旋转和平移，使结构对之间的TM-score最大化；“收敛”指当TM-score不再变化时，结束叠合-比对迭代过程。NW DP表示Needleman–Wunsch全局动态规划算法；SS表示二级结构。b–d，US-align执行的不同对齐任务，包括单体结构的成对比对（b）、寡聚复合物的成对比对（c）以及单体结构的多结构比对（MSTA）（d）。e–g，点阵图展示了US-align中的SQ（e）、CP（f）和非顺序（NS）（g）对齐，其中每个黑色方块代表一对对齐的残基。这里，输入RNA结构对的二级结构（即碱基配对模式）以点括号表示法展示，其中“.”表示未配对核苷酸，“<”和“>”表示碱基配对。在SQ对齐中，如果结构1中的残基i和j分别对应结构2中的残基m和n，则满足(i−j)(m−n)>0。在fNS中，(i−j)(m−n)可以为正或负。h，在sNS中，(i−j)(m−n)在二级结构片段内部必须为正，而在二级结构片段之外可以为正或负。在CP中，将一个结构的原始末端连接，并在其他位置生成新的末端，以与另一个结构进行对齐。

1.2 方法的应用

US-align已在学术界被广泛用于大分子结构比较，例如在多种结构预测竞赛中用于模型质量评估。其应用并不仅限于结构相似性分析，准确的结构比对还可服务于多种研究任务，包括基于结构的功能注释、蛋白质-配体相互作用预测、蛋白质-蛋白质及蛋白质-RNA对接、蛋白结构域组装、基于进化的蛋白设计、片段引导的结构模型优化以及生物信息学数据库的构建与整理等。

1.3 与其他方法的比较

尽管US-align并非针对某一特定结构比对任务的唯一方法，也不是唯一基于TM-score构建的程序，但其在多数情况下兼具较高的精度与速度。在针对637个单链RNA结构的成对比对基准测试中，US-align的TM-score提高约6%–39%，同时运行速度至少提升一个数量级。类似地，在31,951对蛋白结构域的比对测试中，其TM-score平均提高约2%–22%，并且运行速度至少提高1.6倍。

虽然部分数据库检索程序在速度上更快，但其性能依赖于预先构建和筛选的结构数据库，并需要对目标结构进行预计算表示，因此并不适用于未知结构之间的直接比较，而US-align则可直接用于通用结构比对任务。

1.4 实现该协议所需的基础

US-align提供三种主要使用方式，包括命令行工具、在线Web服务器以及分子图形系统插件（如PyMOL）。其中，Web服务器和PyMOL插件无需命令行操作，使用方式直观，适合一般结构生物学用户。而在本地计算机上安装并运行命令行版本，则需要具备一定的操作系统环境下的命令行基础知识。

1.5 局限性

尽管US-align具有较强的通用性，但其并不适用于柔性结构比对。在某些情况下，例如同源结构之间存在较大构象变化（如结构域取向变化）时，需要使用专门的柔性比对工具，如FATCAT或Matt。此外，虽然US-align提供了PyMOL插件，但目前尚未支持如UCSF ChimeraX等先进分子可视化软件的插件接口，这些功能有待未来进一步扩展和完善。

1.6 实验设计

为展示US-align在不同场景下的应用，选取了若干具有代表性的结构对作为示例。在单体结构比对中，首先选取两种肌红蛋白（PDB ID: 101m与1mba），其序列相似性较低（约24.5%），但结构相似性较高（TM-score=0.85）；其次选取两种β-葡聚糖酶（PDB ID: 1ajk与2ayh），属于循环置换蛋白；第三组选取tRNA（PDB ID: 1evv）与核糖体再循环因子蛋白（PDB ID: 1eh1），体现蛋白与核酸之间的结构模拟现象。

在多聚体结构比对中，选取了一对较难对齐的八聚体结构（PDB ID: 4jhm与4iaj），其序列相似性极低（约5.3%），结构相似性中等（TM-score=0.54）。在多结构比对（MSTA）中，则选取了多个tRNA（PDB ID: 1evv与3am1）以及一个前体RNA（PDB ID: 6jxm），其序列相似性范围在35.2%至50.0%之间。

这些示例主要用于展示复杂比对情形及结构可视化效果。实际应用中，只要提供PDB或mmCIF格式的三维结构文件，均可使用US-align完成相应的结构比对任务。